[发明专利]血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测技术，主要涉及血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

胆汁酸是胆固醇的代谢产物，在肝脏内主要经胆固醇7α-脱羟酶经典途径的合成，分泌入肝胆管储存于胆囊内，在食物刺激下排入肠道后，经肠肝循环进入肝门静脉被肝细胞重吸收。胆汁酸可促进脂类物质的消化吸收和增加胆固醇的溶解度防止胆石生成。胆汁酸的升高主要与肝胆疾病有关，在其他疾病如妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)也有不同程度升高。目前认为血清总胆汁酸水平是唯一可同时反应肝脏分泌，肝脏合成与代谢以及肝细胞损伤三方面的血清学指标。与其他临床生化指标(转氨酶，胆红素等)相比，胆汁酸的测定也更有助于早期肝硬化的诊断，急性肝炎的预后判断以及区分活动性和非活动性慢性肝炎等，具有重要的临床价值。

目前，血清总胆酸的测定方法主要包括以下几种：

(1)质谱法能准确测定胆汁酸分子量，对胆汁酸进行分型，但胆汁酸结构比较复杂，需要对结果进行繁琐的分析。检测仪器昂贵，操作复杂且需专人操作，样本需要纯化以避免堵塞仪器。且有离子源产生的记忆效应，污染等问题。

(2)色谱法能很好地分离并定量分析血清胆汁酸，但是测定血清胆汁酸前需要对样本进行衍生化和水解，使整个检测过程复杂化，增加了检测时间，不适合临床的广泛应用。

(3)放射免疫分析法操作简单，但其生物试剂稳定性会受多种因素影响，且存在放射性污染，对环境和工作人员带来的危害是难以预料的。

(4)酶循环法已经在临床得到运用，但试剂价格昂贵，容易造成检测仪器污染，影响测定结果，且需要专用的检测仪器，仪器昂贵难以移动。

电化学分析方法是仪器分析方法的重要组成部分之一。它是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质某些量之间的计量关系的基础上，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。应用电化学分析方法测定血清总胆汁酸具有如下优点：设备简单可移动性强，操作简便检测迅速，灵敏度高，选择性好。目前，国内外还没有关于电化学分析方法检测血清总胆汁酸的试剂盒及其使用方法的相关研究报道。

发明内容

本发明致力于提供一种试剂简单，价格低廉，使用方便，高性价比的血清总胆汁酸检测试剂盒，本发明的血清总胆汁酸检测试剂盒，采用电化学分析方法对血清总胆汁酸进行快速准确的测定。

本发明的血清总胆汁酸检测试剂盒的检测原理为：利用血清样品中的胆汁酸能在3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)特异性地催化下与氧化型辅酶I(NAD⁺)反应生成3-酮类固醇及还原性辅酶I(NADH)，NADH在丝网印刷电极表面被氧化生成NAD⁺，同时失去两个电子产生电信号；利用电化学仪对NADH所产生的氧化峰电流进行检测，其氧化峰电流与血清中胆汁酸的浓度呈正相关，从而实现对血清总胆汁酸的间接定量分析。

一种血清总胆汁酸检测试剂盒，包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3α-HSD、NAD⁺及丝网印刷电极。

其中，所述丝网印刷电极包括PET基板，PET基板上以碳浆印制工作电极和辅助电极、Ag／AgCl浆印制成参比电极，工作电极、辅助电极和参比电极与相应的电极触点间通过碳浆连接，再在PET基板上除工作电极、辅助电极和参比电极形成的一圆形工作区域外印刷上一层绝缘胶。

更优地，所述血清样品预处理液为甲醇。

更优地，所述3α-HSD活性为40U／mL，所述NAD⁺浓度为100mmol／L。

更优地，所述磷酸盐缓冲液为0.2mol／L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液。

其中，所述磷酸盐缓冲液由0.2mol／L磷酸氢二钠溶液和饱和氢氧化钠溶液配制。

一种所述的血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)用所述血清样品预处理液除去血清样品中的蛋白；

2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用磷酸盐缓冲液复溶；

3)分别取步骤2)得到的溶液、3α-HSD溶液及NAD⁺溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应10min，得到胆汁酸酶催化反应混合液；

4)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。

本发明所述血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：