[发明专利]新型杂合几丁质酶的创制

说明书

一、技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种获得产量提高、活性增强的杂合几丁质酶的方法。

二、背景技术

由于传统化学农药存在靶标生物抗性、非靶标生物毒性等问题，人类迫切需要开发绿色农药。几丁质(chitin)是N-乙酰葡萄糖胺以β-1，4-糖苷键连接而成的线性多糖。由于几丁质是昆虫体内重要的结构组分(外骨骼和围食膜)而不存在于高等动植物体内，因此几丁质被认为是绿色农药研发的独特靶标。其中几丁质酶(chitinase，EC3.2.1.14)在几丁质降解中发挥着重要作用，目前已经成为国内外研究的一个热点。但是目前存在的一个突出问题就是几丁质酶活性不高，因此如何提高它们的酶活性就成为迫切需要解决的问题。

几丁质酶一般包括信号肽(signal peptide)、催化域(catalytic domain)、几丁质结合域、粘蛋白III型同源区(Fibronectin typeIII like domain)及铰链区等多个功能区。其中，催化域的相似性较高，而其他结构域的差异较大。近年来，通过缺失结构域等方法对各个结构域的功能进行了一些研究，发现几丁质结合域对几丁质酶活性影响巨大。

几丁质结合域能帮助几丁质酶结合到几丁质底物上，提高局部区域的酶浓度，同时还能部分破坏多糖分子之间的物理结构，从而促进对底物的降解。根据几丁质结合域三维结构的不同，可以分成三类：I、II和III型。真菌和植物的几丁质结合域属于I型；病毒和昆虫的几丁质结合域属于II型；细菌的几丁质结合域属于III型。这三种类型的结合域在功能上是否存在差异，目前还不清楚，但大量的研究表明缺失几丁质结合域的几丁质酶对可溶性底物的水解能力没有变化或变化不大，但是对不可溶几丁质的水解能力却降低，并且抑菌效果、杀虫效果也降低了。另一方面，在不具有几丁质结合域的几丁质酶上添加几丁质(或多糖)结合域可以增加几丁质酶在底物表面的浓度，从而提高分解几丁质的能力。如哈兹木霉的几丁质酶基因Chit42中没有几丁质结合区域，在该基因表达产物的C端添加几丁质结合区域能显著提高降解几丁质的速度，而且对玉米螟的杀虫效果提高30％。西南大学范艳华等在球孢白僵菌几丁质酶Bbchitl的羧基端添加家蚕几丁质酶、蚜虫几丁质酶以及苦瓜几丁质酶的几丁质结合域均增加了杂合酶对晶体几丁质的结合能力及水解活性。和缺失几丁质结合域的Bacillus licheniformis DSM13几丁质酶(含催化域和几丁质结合域)突变体BliGH相比，用纤维素结合域取代DSM13几丁质酶的几丁质结合域获得的杂合几丁质酶BliGH-CeBD对胶体几丁质的吸附能力、催化能力及构象的稳定性都增强了。令人感兴趣的是将几丁质结合域添加到蛋白酶中也能使蛋白酶获得结合几丁质的能力。还应该注意，在含有几丁质结合域的几丁质酶C端添加外源或自身的几丁质结合域仍然能够提高几丁质酶活性。如在烟草叶蛾的几丁质酶尾部添加水稻几丁质酶的几丁质结合区或再次添加原几丁质酶的几丁质结合区都能提高其结合胶体几丁质的效率和降解几丁质的能力。并且发现，随着几丁质结合域数目的增加，结合效率和降解效率都会进一步提高，即表现出剂量效应。剂量效应在一些含有多个几丁质结合域的几丁质酶中也被发现。如嗜水气单孢菌JP101几丁质酶92有两个重复的几丁质结合域，在它们都存在的情况下，几丁质酶对粉末几丁质和胶体几丁质的结合能力分别是单个几丁质结合域的12倍和10倍。

发明内容

技术问题

本发明的目的是针对目前几丁质酶产量低、活性低、纯度低等问题，提供一种新型杂合几丁质酶的创制方法。

技术方案

本发明是采用如下技术方案实现的：(1)根据几丁质酶基因Chi(chitinase，简称Chi)的全长序列设计引物，在引物5’端增加酶切位点，将几丁质酶基因序列定向克隆进入pET30a载体；然后在几丁质酶的羧基端插入几丁质结合域。这样即重组成表达载体pET-30a-Chi-ChBD，相应表达产物为Chi-ChBD。(2)将步骤(1)中构建好的表达载体pET-30a-Chi-ChBD转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导重组基因的表达，离心收集菌体。(3)用PBS缓冲液重悬达到的菌体，超声破碎，离心收集上清液，得到含有重组几丁质酶的溶液。(4)将含有重组几丁质酶的溶液上HIS镍离子亲和柱，用PBS缓冲液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白，250mM洗脱目的蛋白，透析过夜，得到含有重组几丁质酶的纯化品。上述Chi基因表达载体的构建过程见说明书附图1、2所示。