[发明专利]一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物活性肽的制备纯化领域，涉及一种利用来源于细菌细胞膜脂的模拟细胞膜亲和吸附联用质谱技术快速筛选抗菌肽的工艺，能够实现抗菌肽的靶向性快速筛选及分离鉴定，达到了提高抗菌肽分离纯化效率的目的。

背景技术

抗生素在世界范围内的持续使用已造成了多种抗性菌株的产生，成为全球公共卫生问题。抗菌肽以微生物的细胞膜为靶目标，引起细胞膜的裂解从而导致细胞死亡，具有广谱抗菌活性，且不易产生耐药性，可用于医药、食品、饲料加工业等领域，具有极大的开发应用前景。而目前在抗菌肽的生产方面存在一些问题：直接提取工艺繁琐，成本昂贵，且天然资源有限；化学合成法成本太高，产业化不易实现，同时难以保证合成肽类的生物活性；基因工程方法虽然使获得大量、廉价抗菌肽成为可能，但在实际操作中发现其获得的抗菌肽因空间结构上的差异而导致抗菌能力较弱，常用的细菌表达体系表达产量不高等缺点，因此，如何实现抗菌肽的高通量筛选，是抗菌肽生产和应用亟待解决的问题。

大多数已知的抗菌肽发挥其杀菌、抑菌作用的首要步骤均是与细菌细胞膜的吸附结合，通过其疏水性残基与细菌细胞膜的脂质双分子层相互作用，即抗菌肽与细菌细胞膜间同样存在着特异性的亲和作用。已有基于高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学的原理，利用模拟细胞膜(Mimic cell Membrane，MCM)研究抗菌肽与膜受体相互作用的相关报道，因此将模拟细胞膜应用于抗菌肽的快速、高效筛选理论上是可行的。

目前最常见的模拟细胞膜是由单一或有限种类的磷脂或磷脂类似物制备而成。因其能在水中自发形成模拟真实生物膜的脂双层结构，且具备生物膜的流动性特征，同时克服了真实细胞膜在操作过程中易失活的缺点，因此一直以来被研究者用作真实细胞膜的常用模型。然而抗菌肽在发挥作用的过程中，其吸附结合的真实细菌细胞膜中的磷脂构成、含量、电荷状态等远比目前广泛应用的模拟细胞膜复杂得多。基于真实细菌细胞膜的复杂性，可将其膜脂组分提取出来，在离体条件下将其组装成模拟膜。采用来源于真实细菌的细胞膜脂构建的模拟细胞膜可更加真实的反应抗菌肽与细菌细胞膜脂之间的相互作用，同时克服了真实细胞膜在操作过程中易失活的缺点。目前，国内外尚未见采用来源于细菌的细胞膜脂构建的模拟细胞膜来筛选抗菌的肽相关文献报道。

本专利基于模拟细胞膜与抗菌肽的作用原理，采用细菌细胞膜脂构建模拟细胞膜固定相和色谱柱，同时结合质谱技术快速筛选抗菌肽。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用细菌膜脂构建模拟细胞膜快速筛选抗菌肽的工艺，包括如下步骤：

(1)将经三代试管斜面活化培养的细菌转接入液体培养基中培养至对数期，离心弃培养基取得菌体，无菌水清洗菌体数次以除去残留培养基；

(2)将步骤(2)中得到的菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液(25mM，pH7.5)中，向此菌悬液中加入氯仿-甲醇(1∶2，V／V)混合溶液，室温下搅拌60～90min后，依次加入等体积氯仿和无菌水，继续搅拌20min～30min，收集氯仿提取物，旋蒸除去氯仿，通氮气除去残留溶剂，得到细菌细胞膜脂；

(3)硅胶在20％HCl中回流6～10h，用去离子水洗至中性，110～120℃干燥，制得活化硅胶；

(4)将步骤(2)中得到的细菌细胞膜脂溶于氯仿／甲醇(19∶1，v／v)中，将步骤(3)中得到的活化硅胶加入到上述溶液中，4℃振摇30～60min，旋转蒸发除去溶剂，通氮气除去残留溶剂，细胞膜脂即包覆在硅胶表面形成干的细胞膜脂薄膜，将其用pH7.2的10mM磷酸盐缓冲液溶胀6h～10h，细胞膜脂自发形成模拟细胞膜脂质体，上清液离心去除，用磷酸盐缓冲液洗涤包裹有模拟细胞膜的硅胶，至洗涤液中无磷检出为止，离心沉降物即为细菌膜脂源模拟细胞膜亲和固定相；

(5)将蛋白以两种蛋白酶进行复合酶解，控制料液比1∶8～1∶20，37～60℃下调节pH2.0～9.0，水解结束后，调回pH到6.8～7.0，100℃煮沸灭酶10min，随后将其快速冷却至室温；

(6)将步骤(5)中所得蛋白酶解液进行离心操作，离心条件为：温度4～25℃，时间10～15min，转速8000～12000r，离心结束后，取上清液，经100Da透析袋透析，再将其置于预冷温度为-86℃超低温冰箱中预冻，预冻时间为2～6h，随后进行真空冷冻干燥，设置参数为-55～-45℃，压力0.03～0.2mBar，冻干时间为48～72h，冻干粉配成等浓度溶液进行抗菌试验，取抗菌能力最好的组分-20℃保存留用；