[发明专利]一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用。

背景技术

多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源进行快速生长的甲醇营养型酵母，它除了和其他酵母菌一样具有与高等真核生物相似的基因表达调控和蛋白质翻译后修饰机制外，还具有独特的有利于外源蛋白高效表达的机制，如内源甲醇氧化酶(methanol oxidase)基因启动子MOXp是强诱导型启动子，对葡萄糖或甘油的阻遏不敏感，在葡萄糖或甘油限制或缺乏的条件下，能够被甲醇诱导启动外源基因的高效表达，因此细胞培养和蛋白表达可分时相控制，工艺过程的可控性好。多形汉逊酵母是一种耐热酵母，最适生长温度为37-43℃，因此生长速率快，有利于缩短大规模发酵的培养时间，而且为通过发酵温度变化实现蛋白表达控制提供了便利。它能够同时利用五碳糖和六碳糖，对环境胁迫的耐受性高，在简单廉价的培养基中可实现高密度发酵，并且其对表达蛋白的合适的糖基化修饰有利于提高蛋白的生物活性和稳定性。多形汉逊酵母内源的分泌型蛋白少，有利于外源蛋白的分离纯化。因此多形汉逊酵母是目前国际上公认的最理想的外源蛋白表达系统之一，在蛋白质结构功能的晶体学研究、蛋白质药物、高效生物催化剂、工农业生产过程中功能性蛋白的高效制备中发挥着非常重要的作用。

无论外源蛋白在多形汉逊酵母中的高效表达，还是多形汉逊酵母对五碳糖和六碳糖的高效利用和转化，都需要通过对宿主菌的遗传操作来实现。同时随着对多形汉逊酵母全基因组序列的不断揭示，需要对大量功能未知的基因进行遗传操作以研究和明确其功能及生物学意义。

在汉逊酵母遗传操作中常用的筛选标记主要有两种，一种是抗生素抗性基因，如KanMX6、zeoR等，另一种是营养缺陷互补标记，如URA3、TRP1等。然而，这种筛选标记存在很多局限性。首先，汉逊酵母菌株利用一种标记获得了抗生素抗性或者营养缺陷得到互补之后，这种标记就不能再次使用，限制了对多基因功能的研究和改造。另外，带有抗生素抗性基因的转基因菌株在实际应用过程中会存在潜在的危险。因此，建立简便高效的、具有反向筛选功能的遗传操作体系对多形汉逊酵母的功能基因组学、蛋白表达研究和代谢工程改造等具有非常重要的现实意义。

目前，在多形汉逊酵母中可应用的反向筛选标记主要是乳清苷5-磷酸脱羧酶基因URA3和5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶基因TRP1，其中前者乳清苷5-磷酸脱羧酶能将5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质，后者5-磷酸核糖氨基苯甲酸异构酶能将2-氨基-5-氟苯甲酸（5-FAA）转化为有毒物质，因此在5-FOA或5-FAA存在下迫使带有上述筛选标记的多形汉逊酵母细胞利用标记两侧的同向重复序列重组从而去掉URA3或TRP1，获得上述筛选标记丢失细胞，即进行反向筛选。但这种反向筛选方法只限定在ura3缺陷型或trp1缺陷型的汉逊酵母细胞中使用，同时假阳性比例较高，筛选效率低。

大肠杆菌的mazF基因编码产物能特异识别和切割mRNA的5'-ACA-3'序列，从而对细胞产生致死效应，它作为一种毒性蛋白是否可应用于多形汉逊酵母遗传操作中的反向筛选标记还没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用。

本发明提供的一种用于对多形汉逊酵母中目的基因进行敲除的DNA片段组，由DNA片段甲和DNA片段乙组成；

沿着5’端至3’端的方向，DNA片段甲的结构为：目的基因5’端序列—m—mazF表达盒—抗性筛选标记基因表达盒部分片段A；

沿着5’端至3’端的方向，DNA片段乙的结构为：抗性筛选标记基因表达盒部分片段B—n—目的基因3’端序列；

抗性筛选标记基因表达盒是用于筛选重组多形汉逊酵母菌的；

mazF表达盒能够在重组多形汉逊酵母菌中表达mazF蛋白；

抗性筛选标记基因表达盒部分片段A为抗性基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的5’末端开始至抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基处结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段B为抗性筛选标记基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基开始至抗性筛选标记基因表达盒3’末端结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的3’端与抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的5’端有部分重叠序列，该部分重叠序列供DNA片段甲和DNA片段乙发生同源重组从而在汉逊酵母细胞内形成完整的抗性筛选标记基因表达盒；