[发明专利]检测RUNX1基因第3外显子突变位点的方法和引物

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测RUNX1基因第3外显子突变位点的引物和方法。

背景技术

急性髓性白血病(AML)是由于髓系造血干／祖细胞发生累积性获得性基因改变,导致细胞增殖、分化和凋亡途径发生改变的一种恶性疾病。

RUNX1又称为AML1,是RUNX转录因子蛋白家族中的成员之一,是白血病染色体易位最常见的靶位点。RUNX1是十分重要的转录因子,可双向（促进或抑制）调节造血相关因子，从而调节造血干细胞的分化、凋亡及自我更新。RUNX1点突变常可以发生在骨髓增生异常综合征(MDS)、AML、慢性粒单核细胞白血病(CMML)中，在骨髓增殖性肿瘤(MPN)中较少见。有研究指出，RUNX1的突变率在AML中是32%，MDS中是23%，CMML中是37%。在儿童白血病细胞中，已发现多种非随机染色体易位,其中RUNX1受累最多,约占儿童白血病病例30%以上，如t(12;21)(TEL-RUNX1)、t(8;21)(RUNX1-ETO/MTG8)、t(16;21)(RUNX1-MTG16)等。RUNX1突变预示患者预后不良。对患者进行RUNX1突变筛查可能有助于进行临床危险分层和制定治疗决策。

文献报道中，人们虽然未发现RUNX1基因存在突变热点，但是一般都会检测到它的第1-8外显子的突变情况。另有文献报道第3、4、5、8外显子出现突变的概率较高，本发明中主要是针对第3外显子突变情况的检测。

目前可用基因突变检测的方法有限制性片段长度多态性（ssCp）、基因测序和荧光定量PCR等。ssCp技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断，由于方法本身的技术限制，检测灵敏度低。采用荧光定量PCR法检测RUNX1基因第3外显子突变，由于检测的外显子序列较长并且涉及多个突变位点，所以需要设计多对引物及探针，既设计3条突变型探针与RUNX1基因第3外显子覆盖的3个突变位点分别特异性结合，设计3条对应的野生型探针分别与3个位点未突变的DNA结合，既检测一个DNA样本需同时进行3管PCR反应，每管反应体系包括1对扩增引物，1条野生型探针，1条对应的突变型探针，对样本DNA的用量较大,检测成本也很高，给临床应用带来了不便。此外，现有技术仅仅是检测突变发生概率较高的单位点突变，而没有检测第3外显子的整体突变情况。

本发明采用Sanger测序法检测RUNX1基因第3外显子的突变，并且设计的引物可以扩展整个第3外显子，覆盖待检测的所有突变位点，既检测一个DNA样本仅需要进行1管PCR反应，与荧光定量方法比较可以节省2/3的DNA样本用量，并且很大程度的节省了检测成本。

发明内容

本发明提供检测RUNX1基因第3外显子突变位点的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测AML患者体内RUNX1基因第3外显子突变位点的突变情况。

本发明的目的在于提供检测RUNX1基因第3外显子突变位点的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖RUNX1基因第3外显子突变位点的正、反向引物；其碱基序列为：

RUNX1-exon3-F：CCTAACTCAATCGGCTTGTTGT

RUNX1-exon3-R：GGCCAGTACCTTGAAAGCGAT。

进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为

RUNX1-exon3-S-F：CCTAACTCAATCGGCTTGTTGT

RUNX1-exon3-S-R：GGCCAGTACCTTGAAAGCGAT。

进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：RUNX1-exon3-F:RUNX1-exon3-R=1:1。

进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：RUNX1-exon3-S-F:RUNX1-exon3-S-R=1:1。

本发明的目的还在于提供一种检测RUNX1基因第3外显子突变位点的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)利用一对扩增引物RUNX1-exon3-F和RUNX1-exon3-R对(1)中的DNA进行扩增，获得覆盖RUNX1基因第3外显子突变位点的扩增产物；

(3)利用一对测序引物RUNX1-exon3-S-F和RUNX1-exon3-S-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与野生型RUNX1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，