[发明专利]检测RUNX1基因第5外显子突变位点的方法和引物

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测RUNX1基因第5外显子突变位点的方法和引物。

背景技术

急性髓性白血病(AML)是由于髓系造血干／祖细胞发生累积性获得性基因改变,导致细胞增殖、分化和凋亡途径发生改变的一种恶性疾病。

RUNX1又称为AML1,是RUNX转录因子蛋白家族中的成员之一,是白血病染色体易位最常见的靶位点。RUNX1是十分重要的转录因子,可双向（促进或抑制）调节造血相关因子，从而调节造血干细胞的分化、凋亡及自我更新。RUNX1点突变常可以发生在骨髓增生异常综合征(MDS)、AML、慢性粒单核细胞白血病(CMML)中，在骨髓增殖性肿瘤(MPN)中较少见。有研究指出，RUNX1的突变率在AML中是32%，MDS中是23%，CMML中是37%。在儿童白血病细胞中，已发现多种非随机染色体易位,其中RUNX1受累最多,约占儿童白血病病例30%以上，如t(12;21)(TEL-RUNX1)、t(8;21)(RUNX1-ETO/MTG8)、t(16;21)(RUNX 1-MTG16)等。RUNX1突变预示患者预后不良。对患者进行RUNX1突变筛查可能有助于进行临床危险分层和制定治疗决策。

文献报道中，人们虽然未发现RUNX1基因存在突变热点，但是一般都会检测到它的第1-8外显子的突变情况。另有文献报道第3、4、5、8外显子出现突变的概率较高，本发明中主要是针对第5外显子突变情况的检测。

目前可用基因突变检测的方法有限制性片段长度多态性（SSCP）、基因测序，焦磷酸测序，荧光定量PCR等。SSCP技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断，由于方法本身的技术限制，检测灵敏度低。采用荧光定量PCR法检测虽然灵敏度较高，用时较短，但并不适用于RUNX1基因第5外显子突变的检测。原因在于检测该基因的外显子序列较长并且主要涉及5个突变位点，且第198位氨基酸位点的突变和第202位氨基酸位点的突变，都可以发生在两个连续的碱基，即第198位氨基酸位点的592G>A突变、593A>T突变，第202位氨基酸位点的601C>T突变、602G>A突变。荧光定量PCR（探针法）主要适用于检测单个碱基的突变，若要检测多个突变位点，则需要设计设计多对引物和多条探针，并进行多管PCR反应，同时还需使用相配套的实时荧光PCR仪，这会增加检测成本和样本DNA用量，而荧光定量PCR的染料法检测基因突变存在引物特异性差的问题，检测结果假阳性率高。焦磷酸测序技术由于检测的有效片段仅50bp左右，如果发生突变的多个位点之间相隔超过50bp的话，那么需要设计多对测序引物，并进行多管PCR反应，这也会成倍增加检测成本和样本DNA用量。此外，现有技术仅仅是检测突变发生概率较高的单位点突变，而没有检测第5外显子的整体突变情况。

本发明采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法检测RUNX1基因第5外显子的突变，并且设计的引物可以扩展整个第5外显子，包括待检测的所有突变位点。Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。

发明内容

本发明的目的在于提供检测RUNX1基因第5外显子突变位点的引物，其特征在于，包括：扩增RUNX1基因第5外显子突变位点的正、反向引物；其碱基序列为：

RUNX1-exon5-F：ATTAATGATTGGTTATTCAACAG

RUNX1-exon5-R：AATCTGAGACATGGTCCCTG。

进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为

RUNX1-exon5-S-F：ATTAATGATTGGTTATTCAACAG

RUNX1-exon5-S-R：AATCTGAGACATGGTCCCTG。

进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：RUNX1-exon5-F:RUNX1-exon5-R=1:1。

进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：RUNX1-exon5-S-F:RUNX1-exon5-S-R=1:1。