[发明专利]一种制备(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用生物酶催化制备(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇分子式为C₈H₈BrNO₃，英文名R-2-bromo-1-(4-nitrophenyl)ethanol，与(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇互为对应异构体，是一种重要的手性化合物，是合成β-肾上腺素受体阻断剂-(R)-硝苯洛尔药物的重要中间体。

该类化合物的制备方法有拆分法和合成法。拆分法包括化学拆分和生物拆分，但其最大收率不超过50％；合成法包括化学合成法和生物合成法，其中化学合成法的收率在70～90％，对映体过量(ee)值50～80％，其所用催化剂价格昂贵，产物的光学纯度不高，后期金属离子的去除不理想，且药物中对于金属离子的严格要求都限制着化学合成。生物催化法具有高效性，高立体选择性，反应条件温和等优点，近年来得到广大研究者的青睐。目前脂肪酶是最为普遍和常用的生物催化剂，包括脂肪酶催化的水解反应和脂肪酶催化的酯化反应，脂肪酶催化的水解反应中ee值和转化都不高，据报道脂肪酶催化的酯化反应中来自于洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia)的脂肪酶PS-C-II，在水和甲苯有机溶剂组成的两相体系中催化(R，S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇的反应中可以获得ee>99.5％的单一光学纯(Asymmetry162005717-725)。然而就本质而言，消旋体拆分的最高理论产率为50％。此外羰基还原酶选择性的还原2-溴-4-硝基苯乙酮制备单一光学纯的方法是一个重要和广泛有价值的生物催化手段，例如Luc′₁dio C等利用白地霉(Geotrichum candidu)和红酵母菌(Rhodotorula glutinis)对2-溴-4-硝基苯乙酮为底物，分别生成(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇和(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇，底物浓度只有2mmol／L，而且反应需要添加昂贵的辅酶来提供反应的还原力。

因此，在目前利用生物催化制备(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇的技术中，底物转化率低，产物光学纯度低和辅酶循环再生(控制成本)等问题有待进一步研究解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌表达羰基还原酶不对称还原2-溴-4-硝基苯乙酮制备(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇的方法。

本发明的技术方案：以表达该羰基还原酶(CBR)基因的大肠杆菌BL21(pET28a-cbr)耦合葡萄糖脱氢酶(GDH)重组大肠杆菌BL21(pET28a-gdh)为催化剂，并添加少量NAD(P)H，在有机溶剂二甲基二甲胺／水两相反应体系中实现不对称还原2-溴-4-硝基-苯乙酮高效制备(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇。

上述所用羰基还原酶基因(cbr)构建在载体pET28a上并在大肠杆菌(BL21)中表达。葡萄糖脱氢酶基因(gdh)构建在载体pET28a上并在大肠杆菌(BL21)中表达。构建好BL21(pET28a-cbr)、BL21(pET28a-gdh)和BL21(pET28a)由本实验室保藏。

BL21(pET28a-cbr)重组菌能不对称的制备(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇，而BL21(pET28a-gdh)又能够以葡萄糖为辅助底物，使得NAD(P)H再生循环，因而加入少量NAD(P)H就能现实反应中NAD(P)H的高效循环利用。

利用上述重组大肠杆菌不对称制备(R)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇的方法如下：

以2-溴-4-硝基苯乙酮为底物，二甲基甲酰胺为助溶剂，以葡萄糖为辅助底物，以NAD(P)H为辅因子，由BL21(pET28a-cbr)和BL21(pET28a-gdh)的重组大肠杆菌进行转化反应不对称制备(S)-2-溴-1-(4-硝基苯基)乙醇，具体反应流程见图1。

所述的底物2-溴-4-硝基苯乙酮的初始反应浓度为2～10g/L，葡萄糖初始反应浓度0.1～2mol／L、辅因子NADPH的初始浓度为0～1.5mmol／L，重组大肠杆菌的用量以湿细胞计为10～100g/L，双菌体质量比为0.5～4。

所述的反应温度为15～40℃，反应转速为50～200rpm，反应时间2～16h。