[发明专利]一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物遗传育种技术领域，具体地涉及一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法。

背景技术

兰花(Cymbidium )是世界名花，集观赏、经济和文化价值于一身，深受世界各国人们的青睐。我国是兰花资源最丰富的国家，已知有49种，占世界总数的三分之二以上（刘仲健等，2006），国外利用这些资源，在英国皇家学会已登录兰花集体杂种近15000个，并培育出大量的商业化品种，但国内培育出的兰花新品种和登录的杂种均较少，而具有商业化前景的品种数就更稀少。种质资源是育种的物质基础，创造关键性的种质资源是培育具有突破性品种的关键，因此研究种质资源的创新方法对更好利用我国兰花资源，培育具有突破性的兰花新品种具有十分重要的意义。

多倍体育种是兰花育种的重要手段，目前商业化的大花蕙兰品种多为多倍体（朱根发等，2006），而创建多倍体资源是开展兰花多倍体育种的关键。兰花多倍体资源的创建可以通过物理、化学和生物学的方法，与传统的物理和化学法创造多倍体的方法相比，利用生物学（2n配子途径）创建多倍体具有独特的优越性，它不仅可直接获得三倍体，四倍体资源，而且可以传递亲本更高的杂合性以及能够克服杂种不育。目前国内外学者，利用2n雄配子途径已经成功获得百合;（Barba-Gonzalez et al,2006;Barba-Gonzalez et al, 2005）、月季（Crespel et al , 2006）、秋海棠（Dewitte et al, 2010）和彩色马蹄莲（吴红芝等，2011）等具有重要的观赏价值的多倍体资源。

2n雄配子可自然发生也可以人工诱导，人工诱导2n雄配子的主要方法有物理方法和化学方法。物理方法包括温度激变、气体诱变和电离辐射等。化学方法包括秋水仙素、安磺灵(Oryzalin) 及氟乐灵( Trifluralin )以及咖啡碱等。目前在兰花育种中，人工诱导2n雄配子的研究报道较少，范彬等（2012）利用秋水仙素诱导春剑2n雄配子，其最高诱导率为2.65%、P WongprichAC（活性炭）han et al（2013）利用N₂O成功诱导蝴蝶兰2n雄配子。无论是物理方法或是化学方法诱导2n雄配子，均存在2n雄配子竞争力下降，诱导率偏低和效率不稳定等问题，这导致2n雄配子无法有效的运用于育种实践。

因此，创建自然高效发生2n雄配子的兰花资源成为开展兰花多倍体育种的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中物理方法和化学方法诱导2n雄配子，均存在2n雄配子竞争力下降，诱导率偏低和效率不稳定的缺陷，提供一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法。本发明与传统物理、化学方法相比，2n雄配子发生稳定、活力高、可长期重复使用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

    一种创建兰花高效发生2n雄配子资源的方法，其特征在于，包括如下步骤：

    S1.远缘杂交组合配置：选择适宜亲本，配置杂交组合，在适宜的条件下栽培母本植株，获得果实；

    S2.杂种群体构建：对果实进行消毒，取其种子进行无菌培养获得中间繁殖体，对中间繁殖体进行植株再生，获得试管苗，试管苗移栽后，栽培至植株开花；

S3.2n雄配子的鉴定：待植株开花后，取不同株系植株新鲜成熟花粉，采用直接压片法制片后，在光学显微镜下观察2n花粉，统计2n花粉的发生频率；

S4.高效发生2n雄配子资源筛选：对发生率大于1%的植株进行分株繁殖，并进行两年以上重复鉴定，筛选出发生率高且稳定的株系为兰花高效发生2n雄配子资源。

    根据本发明的方法，其中，步骤S1所述远缘杂交组合配制技术包括以下步骤：

    亲本的选配原则：远缘杂交常存在杂交不亲和性的问题，亲本的亲缘关系不能太远，应该注意选配亲和性相对较高的品种，亲本的花粉活力要高；其次避免选择第一次开花的兰株做亲本；最后选择种子易于萌发的品种做亲本，以保证可以获得杂种后代。

    杂交技术：选择健壮无病的植株作父母本，用镊子取出母本当天开花花朵中的花粉块，然后将父本的花粉块放入母本的蕊腔中，用铅笔在纸牌上写明杂交组合的名称，杂交时间，挂在母本植株上，并将其置于温暖通风的地方，防止寒潮。

    步骤S2所述杂种群体构建技术包括以下步骤：