[发明专利]一种检测副溶血性弧菌的核酸侧向流试纸条检测试剂盒的制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及食品及加工原料中副溶血性弧菌的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。 

背景技术

为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保证食品领域的公共安全，需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中，在我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌等病原菌。副溶血性弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，主要的栖息地在海水中。食用此菌污染食品可引发食物中毒，临床表现为急性起病，主要症状包括腹痛、呕吐、腹泻及水样便等。 

在传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中常规的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期长，同时对于有些细菌仍无法给出快速和准确的鉴定，不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定，这类方法因灵敏度高、特异性好、耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通/荧光PCR方法、以及环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、分支滚环扩增（hyper-branched rolling cycle amplification，HRCA）及链替代扩增(SDA)等恒温扩增-检测技术。 

荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。发明专利“副溶血性弧菌多重定量PCR检测试剂盒及检测方法(公开号：CN102605055)”、 “一种定量PCR检测试剂盒及用于检测副溶血性弧菌的方法（CN200410077367）”、“副溶血性弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒公开号：CN101153330”等专利中，分别描述了以常规PCR结合凝胶电泳或荧光信号分析的PCR检测技术，为提高检测的准确性和灵敏度，发明专利“副溶血性弧菌双重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法（公开号：CN102146469）”设计了对针对toxR和tdh两个基因片段的双重定量PCR检测方法，利用标准质粒进行定量分析，效果显著。常规的PCR扩增检测需要对PCR产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度，实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测。 

发明专利“副溶血性弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒”（公开号：CN201110366145）则提供了以恒温扩增结合凝胶电泳或原位杂交进行检测的方法，该类方法不需循环变温PCR，可以明显提高检测的灵敏度，但检测手段并无明显改良，操作仍嫌复杂。 

另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法，其检测对象主要是蛋白质分子，竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子，这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现，是快速检测的常规方法，具有快速、简单、成本低廉的优点，广泛用于食品中毒素、病原微生物以及农药、抗生素残留的筛查。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应，用酶联免疫吸附（ELISA）方法或免疫胶体金试纸条或完成检测，公开号为CN102659942的如发明专利“副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒”即提供了一种以多克隆抗体作为捕获抗体，以针对副溶血性弧菌鞭毛蛋白的单克隆进行检测的ELISA方法，利用特异抗体与病原微生物的结合还可以进行检测前的富集。 

在免疫胶体金检测中，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成肉眼可见的有色沉淀线，对蛋白的检测依赖高亲和力和高特异性抗体的获得，在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则，DNA较蛋白质更易于产生序列差异，这种差异也更易于准确检出，通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率，通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。