[发明专利]抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗及制备方法

权利要求书

1.一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该序列包含有MS2外壳蛋白及O型口蹄疫病毒的VP1上优势抗原决定簇序列。

2.如权利要求1所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于所述疫苗由SEQ ID NO.2所示的DNA序列编码，此DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外壳蛋白基因和O型口蹄疫病毒的VP1上的优势抗原决定簇基因序列。

3.如权利要求1所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于所述疫苗利用大肠杆菌表达，且在大肠杆菌细胞内自主包装为类病毒颗粒结构，以类病毒颗粒形成存在。

4.如权利要求3所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于类病毒颗粒除了表面所展示的O型口蹄疫重要的抗原决定簇外，内部还包裹着口蹄疫病毒的3D基因的反义RNA。

5.如权利要求4所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于该类病毒颗粒内包裹着各种亚型口蹄疫病毒共有的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）3D^pol的3D基因的反义RNA。

6.如权利要求4所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于该疫苗中包裹的反义RNA序列是具有SEQ ID NO.3所示DNA序列的反义RNA序列或与之同源性较高的序列。

7.如权利要求2所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗，其特征在于该DNA序列的第1254～1316位核苷酸为O型口蹄疫病毒的VP1的第141～160位抗原决定簇氨基酸对应的核苷酸；该氨基酸序列是将O型口蹄疫病毒VP1的第141～160位优势抗原决定簇氨基酸插入到噬菌体MS2外壳蛋白的第15位氨基酸后面。

8.用于制备抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗的两种共表达载体，其特征在于，一种表达载体含有SEQ ID NO.2所示的DNA序列，或含有与SEQ ID NO.2所示的的DNA序列不完全同源，但能够翻译出SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的DNA序列，另一种表达载体含有SEQ ID NO.3所示的3D的DNA序列的反义RNA序列，或与之同源性较高的序列。

9.如权利要求1～7中任一所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括：将MS2的成熟酶蛋白和插入了O型口蹄疫病毒的抗原决定簇第141～160位氨基酸基因片段的外壳蛋白基因一起连接到pET28a表达载体中构成如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；设计引物将口蹄疫病毒3D基因如SEQ ID NO.3所示的序列的反义链扩增出来，连接到pCDF-Duet-1表达载体的MCS1处，然后将两个共表达载体转化到BL21(DE3)中；

a)在适宜的培养基、适宜的温度、适宜的振荡条件下培养重组工程菌，通过添加合适的诱导物诱导重组细胞表达并自主包装成类病毒颗粒结构；

b)通过离心，收集经过诱导表达的重组工程菌，反复冻融菌体3次，超声波彻底破碎菌体，15000r/min离心15min，上清即为含类病毒颗粒疫苗的产物；

c)所得表达产物的上清中加入NaCl至终浓度1mol/L，冰浴1h，离心所得的上清中再加入终浓度为10%的PEG8000，冰浴，离心得到类病毒颗粒沉淀，沉淀经氯仿洗涤后再经过蔗糖梯度超速离心得到类病毒颗粒的纯化产物；

d)经蔗糖梯度纯化后的类病毒颗粒即为所述抗O型口蹄疫的类病毒颗粒多肽-核酸双效疫苗。

10.如权利要求1～7中任一所述一种抗O型口蹄疫多肽-核酸双效类病毒颗粒疫苗的应用，其特征在于该疫苗与相应佐剂混合后通过肌肉注射途径对动物进行免疫。