[发明专利]动物细胞用表达载体、其制备方法及应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种动物细胞用表达载体、其制备方法及上述表达载体在真核细胞中高水平表达目标蛋白的应用。

【背景技术】

蛋白质在合成过程中要经过翻译后的加工和修饰，才能成为有活性的蛋白质，其中，翻译后加工过程包括：磷酸化、糖基化、二硫键形成、酰基化和蛋白酶加工等。原核细胞不具备翻译后加工的能力，因此，原核细胞在表达真核生物蛋白时效果。酵母，植物，昆虫细胞虽然能对重组蛋白进行糖基化修饰，但其糖基化方式与哺乳动物细胞不同，有可能产生免疫原性。因此，开发以哺乳动物细胞、尤其是中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）为宿主，获得高水平生产性细胞株的载体成为本领域的当务之急。

采用CHO细胞表达既能保证重组蛋白质的正确糖基化和磷酸化，又能保证重组蛋白二硫键的正确配对和蛋白质的正确折叠，从而使由CHO细胞表达的重组蛋白与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。但是在一般情况下，外源基因在CHO细胞中的表达量很低，很难用于实际工业化生产。为了使外源基因在CHO细胞中获得高水平的表达，有必要探索构建新的表达载体或优化已有的表达载体系统。

在确定宿主细胞后，目的基因的表达产量主要由其表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。影响外源基因在哺乳动物细胞中的表达因素有整合位点、转录效率、mRNA的加工、mRNA的稳定性及翻译效率、目的基因拷贝数和外源蛋白翻译后的加工、分泌和稳定性，基于以上因素，一个高效率的哺乳动物细胞表达载体至少具备以下几个特征：选择性标记、强启动子和增强子、多聚腺苷酸加尾信号（polyA）、终止子等。由于现有技术中的表达载体未能有效整合调控元件，难以获得表达量较高的细胞株，因此，在表达载体中替换或加入有助于提高表达量的调控元件是必须的。

在CHO细胞表达载体中有两类选择标记，其中之一为非扩增基因，如neo基因，该选择标志基因对目的基因的拷贝数没有影响，用于构建瞬时表达载体。现有技术中出现了用neo基因设计载体筛选CHO细胞染色体上的热点的技术，以提高目的基因的表达量。上述表达载体通过弱化neo基因表达，在含有G418的培养基里，只有当人工组建的neo基因整合在染色体DNA的热点部位时，neo基因的表达量足够高，才能保证细胞存活。由于目的蛋白的编码基因和neo基因在同一个表达载体上，该编码基因随neo基因整合在neo抗性的克隆细胞基因组的热点上，重组蛋白的表达量增加。现有技术中主要有两种弱化neo基因表达的方法：第一，在上游进行突变，弱化neo基因的表达翻译起始效率；第二，在neo基因的内部插入一个人工合成的内含子。这两种方法均使neo基因的表达受到了极大的弱化，但是操作繁琐复杂，而且费时费力。采用弱启动子弱化neo的表达，虽然弱化程度可能不如前者，但是操作简便，容易掌握，无疑是一种很好的替代方案。

另一类选择标志具有扩增基因的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶（DHFR）、谷氨酰胺合成酶（GS）等。当携带共扩增基因的表达载体转染CHO细胞后，随着培养基中选择性药物浓度的逐渐增加，使共扩增基因的拷贝数不断增加；同时其侧翼的DNA片段也会相应得到扩增，使目的基因的拷贝数增加几百倍到几千倍，从而达到外源基因的高效表达。表达外源蛋白最成功的这类载体受体系统主要有CHO/DHFR和CHO/GS。dhfr基因编码的DHFR是细胞代谢途径中的一个重要的酶，当细胞缺乏此酶或酶失活时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷才能存活。氨甲蝶呤（MTX）是DHFR的类似底物，可竞争抑制DHFR的活性。当环境存在高浓度的MTX时，dhfr基因可自发地在染色体上扩增其拷贝数，以产生更多的DHFR来维持细胞的正常代谢，当其扩增时，可以与连在它两侧的序列一起扩增，与dhfr基因共扩增的序列的大小通常比dhfr基因要大许多，可达上千个kb，足以包含其两翼的基因序列。这种共扩增实现了目的基因剂量扩增，从而提高表达产量。但是，当采用DHFR共扩增系统时，细胞需在递增MTX浓度的培养基中逐渐适应，操作繁琐而且需要耗费大量时间，并需在高浓度MTX下才能达到最高表达水平。高浓度的MTX对细胞具有毒性，使细胞生长速度变慢，不利于蛋白生产，也不利于基因扩增筛选，同时遗传稳定性也有所下降。