[发明专利]抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗体工程领域，尤其是涉及一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用。

背景技术

20世纪80年代前，世界卫生组织(WHO)一直将心肌酶谱活性作为急性心肌梗死(AMI)的诊断标准之一。20世纪80年代末，科研人员发现，肌钙蛋白(troponin，Tn)的敏感性和特异性高于磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶和天冬氨酸氨基转移酶等生物标志物。心肌肌钙蛋白I（cTnI）仅存于心肌，是心肌细胞的标志物，其异常改变可影响心脏的舒缩功能，并可用于诊断心肌坏死，判断心肌损伤等，成为心肌细胞损伤敏感性和特异性最强的标志物之一，是公认的快速诊断AMI和急性冠脉综合征(acute coronary syndromes，ACS)以及协助ACS危险分层和反映其预后的主要生化标志。

正常人血液中cTnI含量一般低于0.3μg/L。当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流。因此，在发病初期快速、灵敏且准确的测定人血中的cTnI及其变化趋势对急性心肌梗死的诊断、急性冠状动脉综合征的危险分层、监测各种因素导致的心肌损伤等有着重要的临床意义。临床上用于检测cTnI水平的方法有酶联免疫吸附法（ELISA），化学发光，胶体金等，不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于cTnI的特异性单克隆抗体。传统的临床诊断使用的都是鼠源的单克隆抗体（mAb）。

长期以来，鼠源性的单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗，但是由于鼠源性的mAb会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，从而限制了其在临床方面的应用。因此，对鼠源性抗体进行人源化改造是非常必要的。从上个世纪80年代以来，用于治疗的单克隆抗体的发展趋势是从鼠源抗体到人源化抗体再到全人源抗体，目前已经被FDA批准上市的抗体药物中有近半是人源化抗体。而在临床诊断领域，现在使用的基本上还是鼠源性的抗体，但是由于人平常会接触到鼠类接触过的物品，血液中可能会出现HAMA反应，从而存在人抗鼠的抗体，在临床诊断中会出现非特异性反应，即会出现假阳性。

发明内容

基于此，有必要提供一种能显著降低假阳性出现概率的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用。

一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，包括由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。

在其中一个实施例中，所述抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体由保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞产生。

在其中一个实施例中，所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在其中一个实施例中，所述重链可变区含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体的构建方法，包括如下步骤：

分别构建含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因，含有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的重链恒定区的表达基因；

将所述表达载体转染到同一宿主细胞中；

从所述宿主细胞中回收得到所述抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体。

在其中一个实施例中，待插入如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的表达载体预留有XbaI和PmlI双酶切位点；待插入如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体预留有NheI和HindIII双酶切位点。

在其中一个实施例中，所述如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得：

从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA，用反转录试剂盒进行RT-PCR，RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板，以SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6所示的引物序列进行PCR，回收PCR产物，PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中表达；

回收DH5α感受态细胞表达的产物，使用如SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8所示的引物序列进行PCR，得到所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

所述如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得：