[发明专利]L-苯丙氨酸高产菌株及其在发酵生产L-苯丙氨酸中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种L-苯丙氨酸高产菌株及其诱变方法与其在发酵生产L-苯丙氨酸中的应用。

背景技术

L-苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人体和动物不能合成的必须氨基酸之一，也是高甜度低热量的新型甜味剂阿斯巴甜的重要组成部分。作为一种重要的生物化工产品，L-Phe在食品、饲料添加剂以及医药等领域具有广泛的应用。

L-苯丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法和微生物酶法转发法。微生物发酵法是借助生物具有自身所需氨基酸的能力，通过对菌株的诱变等处理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异菌株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏因素，达到过量积累L-苯丙氨酸的目的。例如：复旦大学范长胜等从利用、紫外线-氯化锂(UV-LiCl)和紫外线-亚硝基胍(UV-NTG)对其进行复合诱变处理获得了一株相对出发菌株含量提高50%左右的高产菌株。美国的Monsanto公司凭借对菌种的改良使其发酵产L-苯丙氨酸，产酸率高达45g/L。但是国内对于苯丙氨酸制备方面研究工作相对落后。现有的发酵方法大多采用大肠杆菌为载体的基因工程菌，操作复杂且菌种易退化。在实际生产过程中导致生产不稳定。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一株可大幅度提高发酵产物中L-苯丙氨酸高产菌株。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一株L-苯丙氨酸高产菌株，其分类命名为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum BT-N5086，已于2013年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO.M2013484。

谷氨酸棒杆菌C.glutamicum BT-N5086的形态学及生理生化学特征如下：

菌落颜色：米白色。

需氧方式：好氧生长。

菌落大小：3～6mm。

适宜生长温度：31～33℃。

适宜生长pH：7.0～7.2。

菌体形态：圆形菌落，无光泽。

革兰氏染色：阳性。

本发明要解决的技术问题之二在于提供一种简单、高效、安全的L-苯丙氨酸高产菌诱变方法，能诱变筛选得到前述L-苯丙氨酸高产菌株。

本发明所述的L-苯丙氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌C.glutamicum BT-N5086的诱变筛选方法是：将L-苯丙氨酸出发菌株，经亚硝基胍(NMMG)诱变后，通过摇瓶发酵筛选获得L-苯丙氨酸产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出L-苯丙氨酸产量高的目标菌株。具体步骤如下：

(a)、样品悬浮液液制备：从在固体培养基中的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum培养物中获得待诱变的细胞混悬液：将谷氨酸棒杆菌出发菌株制成镜检无细胞重叠的细胞混悬液。

(b)、为了获得苯丙氨酸高产菌株，经过对比多种诱变方法，选用亚硝基胍(NMMG)诱变谷氨酸棒杆菌C.glutamicum菌株的方法。在20℃和100rpm下，将10⁸细胞／ml步骤（a）的细胞混悬液加入到含有300～500mg／ml亚硝基胍MNNG溶液的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液，在pH5.0的环境下中温浴60～120min，然后将诱变细胞在液体培养基中，26～30℃、100rpm的环境下下培养10小时，得到诱变后的菌液。

(c)、诱变菌株的筛选：

筛选：将步骤(b)诱变后菌液涂在固体培养基上进行分离，然后将固体培养基上的单菌落接入种子培养基，在培养温度31～33℃，240～320rpm摇床转速下扩大培养12～24h后，按5～15%(v/v)的接种量接入发酵培养基。在31～33℃、240～320rpm摇床转速下发酵24～44h后下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中L-苯丙氨酸含量。取发酵液L-苯丙氨酸含量最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a)～(c)，直至筛选出L-苯丙氨酸产量高的目标菌株谷氨酸棒杆菌C.glutamicum BT-N5086。

步骤(b)中亚硝基胍NMMG优选诱变剂量为400mg／ml；步骤(b)中所用的液体培养基为：碳源2.0%～4.0%、氮源0.5%～1.5%、其余为水，pH7.0～7.2；其中所述碳源为淀粉水解糖和糖蜜中的一种或两种的混合；所述氮源为牛肉膏和酵母粉中的一种或两种的混合。