[发明专利]一种强热稳定性的中性蛋白酶

说明书

技术领域

本发明属于酶制剂制备技术领域，具体是一种强热稳定性的中性蛋白酶。 

背景技术

蛋白酶是生物体内的一类酵素（酶），它们能够分解蛋白质。分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的眎和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。 

蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。 

酶的应用已有千年以上的历史，虽然中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，但是广泛应用还是最近几十年的事。随着科学技术的发展，随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国科研工作者一直都致力于中性蛋白酶产生菌的筛选、酶提取、纯化以及酶学性质的研究和应用研究工作，取得了一定的成绩。 

从目前国内中性蛋白酶发展以及研究报道来看，我国中性蛋白酶的研究总体水平来说仍处于一个起步阶段。大量研究表明，微生物发酵生产及遗传工程技术将合成特定氨基酸的基因克隆进入微生物细胞质粒中，从而借助某些微生物增殖生产等，中性蛋白酶已广泛应用，这些方法具有产量较高、生产周期短、成本低等优点。采用基因工程与传统的微生物育种方式结合来提高菌种产酶量是一条值得继续探索的发展途径。综合过去已经取得的成绩以及在研究中存在的问题，今后发展的方向主要有以下几个方面：1.继续通过基因工程与传统的微生物育种技术进一步提高微生物产酶能力。2.采用酶体外定向技术改变酶的底物特异性与适应性，如底物亲和力、pH适应性、耐热性以及耐氧化性等等,为开拓酶的新应用领域做出贡献。3.继续寻找产中性蛋白酶新的菌种，特别是极端微生物源中性蛋白酶显得尤为重要。4.在应用方面，继续开发酶的应用领域，同时，积极开展理论与应用研究，为此酶在食品与其它行业的发展中如何做出更大贡献，将是未来营养研究的重要领域，必将为食品与其它行业 高效、持续、稳定发展开辟新的广阔前景。 

国内目前从事中性蛋白酶生产与销售的酶制剂企业很少，主要是由于所采用生产菌种大多为上世纪八十年代所开发的诱变菌株，产酶能力下降、不太稳定、部分优良性状出现部分退化或丧失，且易受到酵母及噬菌体的污染，对生产造成一定程度的损失。加之，目前我国中性蛋白酶发酵单位相对较低，浓缩成本高，不便保存与运输，而且，通常情况下，酶保存技术属商业机密，因此，有关中性蛋白酶酶保藏的研究仍是一个值得研究的领域。如何获得新的产中性蛋白酶菌株、提高菌株产酶能力以及如何保藏酶将成为一个发展方向。 

中国专利CN1289659C公开了一种产高温中性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其制备高温中性蛋白酶的工艺和高温中性蛋白酶，所述中性蛋白酶适用反应温度为50-70℃，最适反应温度为65℃，适用pH值为5-8，最适pH值为7.0-7.2。在50℃保温1小时酶活力下降10%，在60℃下酶的半衰期45分钟。 

中性蛋白酶是能催化蛋白质肽键水解,最适作用pH值在7.0左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反应速度快、无工业污染、催化反应条件适应性较宽等性质和优点,被应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业,但是由于中性蛋白酶热稳定性差,生产与使用条件复杂,限制了它进一步应用的范围，进一步优化选育产中性蛋白酶的优良菌株，生产出热稳定性强的中性蛋白酶对酶制剂的工业化生产具有十分重要的意义。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服现有中性蛋白酶热稳定性差的缺陷，以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1398-2-12为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经特定发酵条件下的液体深层混合发酵，制得一种热稳定性强、酶活力较高的中性蛋白酶。 

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案： 

所述中性蛋白酶的酶学性质如下： 

（1）温度：该酶温度适应范围较宽，最适作用温度为70℃，在40-70℃之间具有较高的酶活；