[发明专利]水稻缺氮后恢复供氮特异诱导表达的启动子Y8A及应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻缺氮后恢复供氮特异诱导表达的启动子Y8A及应用 

背景技术

目前转基因研究主要以组成型启动子驱动目的基因表达，最典型的是花椰菜花叶病毒中分离的CaMV35S启动子（Hirt et al.,1990;Battraw et al.,1990），以及近年来一些植物来源的启动子，如从水稻中克隆的肌动蛋白基因Actin1的启动子和玉米中克隆的泛素基因ubiquitin启动子（Schledzewski et al.,1994）。但是外源基因的组成型表达往往会造成资源的非必要浪费，同时大量异源蛋白的积累也会打破植物原有的代谢平衡，阻碍植物的正常生长（聂丽娜等,2008；Rai et al.,2009）。Kasuga等（1999）在研究中发现，使用强的组成型表达启动子CaMV35S启动DREB1A的表达时，对植物的生长可能起到某种程度的阻碍作用，而用诱导型的启动子可以减轻这种状况。诱导型的启动子可以快速有效地诱导转录基因的“开、关”：可根据需要在植物特定发育阶段、组织器官或生长环境下接受诱导信号，诱导基因表达，也可以随时解除胁迫，停止表达（李杰等,2006）。因此，获得水稻在氮饥饿状态下诱导表达的启动子，不仅可以减少外源基因大量表达带来的负面影响，更能为基因工程改良水稻提供安全有效的调控。 

在植物生长所需的各种大量元素中，氮素是限制植物生长和形成植物产量的首要因素。氮不仅是遗传物质的基础，更是蛋白质、核酸、叶绿素、酶、维生素、生物碱和植物激素等的重要组成部分（陆景陵,1994）。近半个世纪以来，世界各国都把增施氮肥作为增加水稻产量的重要农业措施，特别是第一次绿色革命之后，随着高产耐肥品种推广应用，农田氮肥施用量迅猛增长，极大提高了水稻的产量(钟代斌等,2001)。农田氮肥的过量施用，随之而来的便是氮素利用率降低以及一系列的环境问题。氮素的大量流失直接导致地下水污染和江河湖泊的富营养化作用（王光火等,2003）。 

随着分子生物学和基因工程在植物领域的迅速发展，植物对氮吸收转运的分子机制也越来越清晰。大量的铵盐转运子、硝酸盐转运子被发现，GS/GOGAT（谷氨酸胺合成酶／谷氨酸合成酶）循环同化铵机理被揭示，为基因工程改良水稻氮的吸收利用提供大量的研究素材。虽然通过突变体或者吸收实验等验证了不少基因的吸收转运功能，但是这些基因在水稻体内的超量表达并未达到提高吸收转运铵的目的。Mohammad等（2006）用玉米ubiquitin启动子超量表达水稻中的铵盐转运子OsAMT1-1，提高了水稻中铵的吸收能力以及根中总铵含量，但同时产生了铵的毒害，导致地上部生物量大量减少。如果改为缺氮诱导启动子驱动，就有可能根据植株的需要，适当控制铵的吸收，避免毒害。GS是参与NH4⁺同化合成谷氨酰胺(Gln)的主要酶，Cai等（2009）用35S启动子在水稻品种中花11中超量表达水稻谷氨酰胺合成酶基因GS1;1、GS1;2和大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因glnA，GS活性、总氮含量、氨基酸含量、可溶性蛋白等都得到了显著提高，但是单株生物学产量及籽粒产量都显著下降了。如果改为供氮诱导启动子驱动，不仅可以降低组成型表达造成的“浪费”,更可以保证仅在供氮充足的情况下促进GS的同化，避免单株因氮源不足而造成生物学产量降低。 

本发明通过芯片发掘了一个供氮诱导基因表达的启动子，用实时定量realtime PCR在三个不同品种中进行了验证，同时通过水稻稳定转化进一步确定了该启动子是一个供氮诱导的启动子，为基因工程改良水稻对氮的吸收利用提供了新的材料。 

发明内容