[发明专利]一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法

权利要求书

1.一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌CCTCC M 2013539为出发菌株经液体深层发酵制备。

2.如权利要求1所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

枯草芽孢杆菌CCTCC M 2013539经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-36℃，恒温培养15-20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体中性蛋白酶；所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5%中草药粉剂。

3.如权利要求2所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,(NH)₂SO₄3-5g，K₂HPO₄6-8g，CaCl₂1-3g，琼脂15-20g，中草药粉剂5-10g，蒸馏水1000mL，pH值7.0-7.2。

4.如权利要求2所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养基重量百分比组成为：麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2。

5.如权利要求2所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水1000mL，pH值7.0-7.2。

6.如权利要求2所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，中草药剂粉5-10%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2。

7.如权利要求2-6任一所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下：称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃-90℃保持2-4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。

8.如权利要求7所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。

9.如权利要求2所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x10⁸-8.0x10⁸个/ml。

10.如权利要求2所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种活化

将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，36℃培养36h进行菌种活化，如此活化3次；

所述斜面培养基组成为：牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g,(NH)₂SO₄5g，K₂HPO₄8g，CaCl₂3g，琼脂20g，中草药粉剂10g，蒸馏水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90℃保持4h，然后降温至60℃，加入混合物料总重量10%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；

所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β-葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β-淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；

（2）液体种子扩大培养

①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度36℃，培养时间15h；

②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度36℃，培养时间15h；

④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度36℃，搅拌速度400rpm，通风量（V/V）1:2,罐压0.05Mpa,培养时间20h；

所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：

酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氢二钾1.5%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠3g，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min；

所述种子罐培养基重量百分比组成为：

麦芽糊精15%，酵母0.8%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米浆0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min；

所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x10⁸个/ml；

（3）发酵罐发酵

将步骤（2）中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度36℃，搅拌速度700r/m，通风量（V/V）1:3,培养时间15h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至5℃，此时，将步骤（2）中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至36℃，恒温培养20h；

所述发酵培养基组成为：麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药粉剂50g，海藻糖40g，酵母粉8g，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g，消泡剂1g,纯净水1000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；

所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草药剂粉10%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min；

所述发酵培养基的调配方法为：

按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.2，加入中温淀粉酶3u/g玉米粉与高温淀粉酶30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.2，123℃灭菌40min备用；

（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量5%中草药粉剂。