[发明专利]一种筛选高含量功能成分石斛培养物的方法

权利要求书

1.一种筛选石斛组培物的方法，该方法包括以下步骤：

（1）种子预处理步骤，包括用NaCl和/或甘露醇处理无菌石斛种子；

（2）种子诱导萌发步骤，包括在含有NaCl和/或甘露醇的诱导培养基中培养种子，使种子萌发后形成原胚体；和

（3）种胚愈伤组织的诱导增殖步骤，包括用愈伤组织增殖培养基培养所述原胚体，形成细胞团或愈伤组织，从而获得石斛组培物。

2.一种提高石斛组培苗中的多糖和/或石斛碱的方法，该方法包括以下步骤：

（1）种子预处理步骤，包括用NaCl和/或甘露醇处理无菌石斛种子；

（2）种子诱导萌发步骤，包括在含有NaCl和/或甘露醇的诱导培养基中培养种子，使种子萌发后形成原胚体；和

（3）种胚愈伤组织的诱导增殖步骤，包括用愈伤组织增殖培养基培养所述原胚体，形成细胞团或愈伤组织，从而获得石斛组培物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

（4）无性繁殖体系的建立步骤，包括在含有NaCl的分化培养基上培养所述细胞团或愈伤组织，形成牙簇群；和

（5）筛选获得石斛组培苗的步骤，包括重复继代所述牙簇群3－5次并逐步降低激素水平直到芽簇适应无激素生长，进行多糖和/或石斛碱含量测定，筛选多糖和/或石斛碱含量高、继代稳定的材料作为石斛组培苗。

4.如权利要求1－3中任一项所述的方法，其特征在于，所述种子预处理步骤包括：灭菌石斛蒴果后获得种胚，用无菌水适量制成种子悬液，在种子悬液中加入终浓度0.2-0.3%NaCl（质量体积百分比浓度）和/或0.1-0.3mol/L甘露醇，进行胁迫处理。

5.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述种子诱导萌发步骤包括：将经胁迫处理的种子转移至诱导培养基中，所述诱导培养基用2/3MS培养基配制，含有400-600mg/L水解干酪素（CH）、400-600mg/L萘乙酸（NAA）、400-600mg/L吲哚乙酸（IAA）、质量体积百分比浓度为2-4％的蔗糖和0.4-0.8％的琼脂，所述培养基还含有质量体积百分比浓度为0.2-0.3％的NaCl和/或0.1-0.3mol/L甘露醇。

6.如权利要求1－5中任一项所述的方法，其特征在于，所述液体愈伤组织增殖培养基以N₆培养基为基础配制，其中，N₆培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变，且N元素含量降至正常量的1/10，且所述培养基含有400-600mg/L水解干酪素、400-600mg/L谷氨酰胺、0.3-0.6mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、0.05-0.15mg/L NAA和2-3%蔗糖。

7.如权利要求3－6中任一项所述的方法，其特征在于，用分化培养基进行培养前还包括用60-100mg/L（优选80-90mg/L）的平阳霉素处理从步骤（3）收集得到的细胞团或愈伤组织18-28小时（优选24小时）。

8.如权利要求3－7中任一项所述的方法，其特征在于，所述分化培养基以2/3N₆培养基为基础配制，其中，N₆培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变，并添加有400-600mg/L CH、0.03-0.08mg/L NAA、0.5-1.5mg/L6-糠氨基嘌呤（KT）、0.3-0.8mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、1-3％蔗糖、0.5-0.8％琼脂，以及0.2-0.3％NaCl和/或0.1-0.3mol/L甘露醇。