[发明专利]一种稳定的含菠萝蛋白酶的凝胶

权利要求书

1.一种含菠萝蛋白酶的水凝胶制剂，含有作为活性成分的菠萝蛋白酶和药学上可接受的载体；其中所述菠萝蛋白酶为经过提纯步骤获得的精制蛋白水解酶。其水解酶活力为每克15-18万单位；蛋白含量为16-20%；所述药学上可接受的载体为PLGA-PEG-PLGA。 

2.根据权利要求1的水凝胶制剂，其中所述精制蛋白水解酶的制备方法如下： 

1）取一定量的外购菠萝蛋白酶，加入15-20倍的pH6.0-7.2，0.02-0.05M的磷酸缓冲液浸提，4-10℃条件下磁力搅拌2-4小时，4000-10000转/分离心10分钟，收集上清液；或者用滤过法除去浸提液中的不溶性杂质； 

2)收集的液体用45%饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀后，离心去掉上清液； 

3)沉淀物再用蒸馏水透析脱盐（1:100），脱去硫酸铵，得浓缩液； 

4)进一步进行冷冻干燥得到精制菠萝蛋白酶；或者浓缩液用冷丙酮沉淀，用冷冻离心机离心后，得到沉淀物，经自然低温干燥可得精制菠萝蛋白酶。 

3.根据权利要求1的水凝胶制剂，其中所述PLGA-PEG-PLGA在25℃下20%的共聚物水溶液粘度为6.9mm²/s。与50%的甘油溶液具有相同粘度，其在浓度为25%时发生胶凝的温度为32℃，即在25℃下，可自由流动，在32℃条件下，体系发生溶液-凝胶转变；所述PLGA-PEG-PLGA是按LA:GA:PEG1500=6:1:3的重量比例反应得到，其制备方法如下： 

1）称量混旋丙交脂6份、乙交酯1份、聚乙二醇15003份； 

2）将混旋丙交脂、乙交酯置于40℃烘箱中挥水2h，同时将聚乙二醇1500放于140℃烘箱中挥水2h； 

3）将挥水后的混旋丙交脂、乙交酯和聚乙二醇1500混与同一西林瓶中并加入催化剂异辛酸亚锡(0.1%，w/w)，真空封盖后压盖； 

4）将封盖后的西林瓶放于140℃烘箱中使其反应12h，完毕后趁热倒出，自然冷却至室温，4℃纯化水溶解，全溶后加热至70℃产生沉淀弃去水层，再加4℃纯化水，重复操作3次，除去反应的单体化合物和低分子水溶性共聚物。 

4.根据权利要求1的水凝胶制剂，根据需要还可加入激动剂，所述激动剂选自：半胱氨酸、硫酸镁、氧化锌；其中，精制菠萝蛋白酶的用量为：10-30%，PLGA-PEG-PLGA的用量为：10-30%，激动剂的用量为：0.1-5%，其余为水。 

5.根据权利要求1的水凝胶制剂，其中，精制菠萝蛋白酶的用量为：20%，PLGA-PEG-PLGA的用量为：20%，激动剂的用量为：0.1-5%，其余为水。 

6.根据权利要求1的水凝胶制剂的制备方法，步骤如下：取精制菠萝蛋白酶，用水溶解，加入到PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，根据需要还可加入激动剂，在低于20℃条件下，搅拌溶解，补水到全量即得。 

7.根据权利要求6的制备方法，其中菠萝蛋白酶的精制方法如下： 

1）取菠萝蛋白酶，加入15倍的pH7.2,0.05M的磷酸缓冲液浸提，4-10℃条件下磁力搅拌4小时，10000转/分离心10分钟，收集上清液；或者用滤过法除去浸提液中的不溶性杂质； 

2）收集的液体用45%饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀后，离心去掉上清液； 

3）沉淀物再用蒸馏水透析脱盐（1:100），脱去硫酸铵，得浓缩液， 

4）进一步进行冷冻干燥得到精制菠萝蛋白酶；或者浓缩液用冷丙酮沉淀，用冷冻离心机离心后，得到沉淀物，经自然低温干燥可得精制菠萝蛋白酶。 

或 

1）取菠萝蛋白酶，加入20倍的pH6.0,0.02M的磷酸缓冲液浸提，4-10℃条件下磁力搅拌2小时，4000转/分离心10分钟，收集上清液；或者用滤过法除去浸提液中的不溶性杂质； 

2）收集的液体用45%饱和度的硫酸铵进行沉淀，沉淀后，离心去掉上清液； 

3）沉淀物再用蒸馏水透析脱盐（1:100），脱去硫酸铵，得浓缩液， 

4）进一步进行冷冻干燥得到精制菠萝蛋白酶；或者浓缩液用冷丙酮沉淀，用冷冻离心机离心后，得到沉淀物，经自然低温干燥可得精制菠萝蛋白酶。