[发明专利]一种诊断类风湿关节炎的microRNA分子标志物及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术诊断领域，涉及用于诊断类风湿关节炎的9种microRNA分子标记物组合及其应用。 

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis；RA)是一类慢性，系统性的自身免疫性疾病，其主要病理改变为关节滑膜明显增厚并有大量炎症细胞浸润，血管翳形成以及软骨组织的侵蚀与破坏。一直以来，类风湿因子和抗环瓜氨酸蛋白抗体是美国风湿病协会诊断标准中的血清学指标，但敏感性和特异性均不高。目前仍不能阐明RA的发病机制及对疾病进行预测，因此找出疾病早期诊断和监测病程的生物标志物显得十分重要。 

miRNA是一类长度约为22个核苷酸，参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，具有高度保守性、时序性和组织特异性。由于miRNA参与机体的各种重要的生理和病理过程，近年来倍受关注。miRNA的出现让人们在对哺乳动物基因组的表达和功能的认识上发生巨大的改变。目前通过不同的实验方法和计算机检测已经证实了在193个物种中存在25141个成熟miRNA(miRBase database，version19.0，August，2012)，到目前为止，在数据库中已经有1223个人类miRN。据估计，一个miRNA可能调控几百到几千个靶基因，因此大约30％-90％的人类基因受到miRNA的调节。miRNA的表达和功能对于不同生理系统的发育和细胞稳态以及机体功能的维持具有重要的作用，寻找疾病诊断的标志物对其准确诊断一直是医学研究领域的重点。miRNA可被分泌释放到细胞外，参与多种炎性和自身免疫性疾病的发病过程。组织细胞内外的miRNA表达图谱的差异使miRNA作为疾病诊断的潜在性生物标志。 

发明内容

本发明的目的在于介绍一种用于检测RA的miRNA标志物组合，通过在miRNA的3’端加上一特异性的茎环引物，通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测被检样本血浆中这些miRNA的含量，并与正常人血浆中相应miRNA的水平比较来诊断RA。 

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一组用于检测RA的miRNA标志物组合，为：miR-9-5p(5’-ucuuugguuaucuagcuguauga-3’，SEQ ID NO.1)、miR-122-3p(5’-aacgccauuaucacacuaaaua-3’，SEQ ID NO.2)、miR-219-2-3p(5’-agaauuguggcuggacaucugu-3’，SEQ ID NO.3)、miR-4634(5’-cggcgcgaccggcccgggg-3’，SEQ ID NO.4)、miR-181d(5’-aacauucauuguugucggugggu-3’，SEQ ID NO.5)、miR-342-3p(5’-ucucacacagaaaucgcacccgu-3’，SEQ ID NO.6)、miR-4764-5p(5’-uggauguggaaggaguuaucu-3’，SEQ ID NO.7)、miR-3926(5’-uggccaaaaagcaggcagaga-3’，SEQ ID NO.8)、miR-3925-3p(5’-acuccaguuuuaguucucuug-3’，SEQ ID NO.9)。 

本发明的优点是：筛查出的miRNA的标志物组合用于诊断RA的特异性和灵敏度高。 

miRNA标志物组合通过以下步骤得到： 

第一步：芯片筛选：选取临床确诊的初发活动期的RA患者5例，健康体检者5例各采 集血浆1ml以上使用miRCURY^TM LNAArray(version18.0)进行表达谱芯片筛选，得出在RA患者血浆中差异性表达的33种miRNA，其中22种miRNA升高，11种miRNA降低。 

第二步：定量PCR初筛：选取临床确诊的RA患者18例，健康体检者14例，通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测芯片筛选得出的33种差异性表达的miRNA，经过第一次PCR剔除Ct值高于35的miRNA,初筛得出22种miRNA。 

第三步：定量PCR验证：选取临床确诊RA患者57例，健康体检者56例，使用上述相同的检测方法，通过差异性分析找出9种在RA患者血浆中差异性表达的miRNA。这九种miRNA的组合在诊断RA的特异性和灵敏度高。 

本发明的再一目的是提供基于上述miRNA集合的检测试剂盒 

技术方案是：一种类风湿关节炎的诊断试剂盒，包括以下成分：