[发明专利]一种糖蛋白质富集纯化方法

权利要求书

1.一种糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

于离心超滤装置中使用酰肼化学法富集糖蛋白质，从而实现对可溶性蛋白质和/或不可溶性膜蛋白质中糖蛋白质的鉴定与分析，具体包括：

（1）采用溶有表面活性剂或去垢剂的氧化缓冲液配制的氧化剂溶液溶解蛋白质样品，并将样品溶液加入至离心超滤装置的超滤管中进行氧化反应；

（2）氧化反应结束后，向超滤管中加入氧化缓冲液配制的亚硫酸盐溶液进行反应，中和多余的氧化剂；

（3）向超滤管中加入悬浮于氧化缓冲液的带有功能化官能团的微球，室温下震荡；

（4）使用pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或尿素溶液清洗步骤（3）中蛋白质样品；

（5）向步骤（4）中蛋白质样品加入还原剂溶液，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；

（6）使用pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或尿素溶液清洗步骤（5）中蛋白质样品；

（7）向步骤（6）中离心后的超滤管中加入烷基化溶液；

（8）使用盐溶液清洗步骤（7）中的蛋白质样品；

（9）使用糖基肽酶酶解的方法获得功能化官能团微球上富集的糖蛋白质，即得所需富集纯化的糖蛋白质样品溶液。

2.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（1）、（2）和（3）中所述的氧化缓冲液体系为醋酸盐和氯化盐混合缓冲液或磷酸缓冲液中的一种；所述醋酸盐和氯化盐混合缓冲液体系中醋酸盐和氯化盐浓度分别为10-200mM，氧化缓冲液体系的pH范围为4-7；

步骤（1）中所述的氧化剂为高碘化物；氧化剂浓度为1-100mM；氧化反应时间为5min-2h；

步骤（1）中所述的表面活性剂包括十二烷基磺酸钠（SDS）、脱氧胆酸钠(SDC)、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、酸性不稳定表面活性剂(Rapigest SF)或壬基酚聚氧乙烯醚-40（NP-40）中的一种或两种以上；去垢剂包括尿素、硫脲或盐酸胍中的一种或两种以上；

步骤（1）中所述的氧化缓冲液中表面活性剂或去垢剂的体积浓度为1%-30%；

步骤（1）中所述的离心超滤装置中的超滤管为底部或侧部置有热密封超滤膜的立体结构装置；超滤膜的截留分子量最小为100,000Da。

3.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（2）中所述的亚硫酸盐溶液浓度为1-200mM，反应时间为5-40min。

4.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：步骤（3）中所述的带有功能化官能团的微球包括带有功能化官能团的磁性微球、琼脂糖凝胶或硅球；

磁性微球为以四氧化三铁/二氧化硅复合纳米磁球为核，使用带酰肼或氨基官能基团的硅烷化试剂制备的磁性微球；琼脂糖凝胶为具有酰肼或氨基反应基团的具有二至二十碳连接臂的琼脂糖；硅球为具有酰肼或氨基反应基团的硅球；

带有功能化官能团的微球与经氧化的蛋白质反应时间为2-24h；

带有功能化官能团的微球的尺寸大小为大于步骤（1）中所选用的离心超滤装置中的超滤膜孔径的尺寸大小。

5.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（4）、（6）和（7）中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；

步骤（4）和（6）中所述的尿素溶液，为由pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液配制的浓度为2-10M的溶液。

6.按照权利要求1所述糖蛋白质富集纯化方法，其特征在于：

步骤（5）中所述的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇；终浓度为1-200mM；

所述的蛋白质变性及还原条件为：

若溶液体系为权利要求5中所述的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液，则蛋白质变性及还原条件为80-100℃水浴下进行，时间为1-20min；

若溶液体系为pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液配制的浓度为2-10M的尿素溶液，则蛋白质变性及还原条件为37-80℃水浴下进行，时间为20min-2h。