[发明专利]鉴别马疱疹病毒1/4型的Lamp检测引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及马疱疹病毒的Lamp引物及其快速检测方法，具体涉及马疱疹病毒1/4型分型检测和鉴定，属于动物病毒病检测、鉴定及防治领域。

背景技术

马疱疹病毒1型（EHV-1）和马疱疹病毒4型（EHV-4）是引起马鼻肺炎（Equine rhinopneumonitis, ER）的亲缘关系密切的两种α-疱疹病毒（alphaherpesvirus）。EHV-1除了引起呼吸道疾病外，主要可致使妊娠母马发生流产，以及偶尔引起马的神经系统疾病；EHV-4主要导致呼吸道症状，偶尔也可引起妊娠母马的流产。EHV-1/4在遗传、抗原性、致病性上密切相关，有许多共同的流行病学、临床和病理特征， 1981年以前一直将其称为EHV1亚型1以及亚型2。序列分析资料也证实，这两个型病毒的基因组既密切相关又有不同程度的差异，由于两种类型病毒存在着广泛的抗原交叉反应性，难以从血清学角度对二者进行区分，既不利于对该病的调查研究，也不利于防控措施的制定。因此寻找一种能够区分二者的分子生物学诊断方法对预防及控制马鼻肺炎具有重要的现实意义。目前EHV的分子生物学检测主要是常规PCR方法,此方法不但需要昂贵的仪器及而且检测时间较长，且分型效果并不理想。

2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，环介导等温扩增反应（Lamp），其特点是针对靶基因的6个或者8个区域设计4个或者6个特意引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件在63℃左右保温30-90分钟，即可完成核酸扩增反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环等过程，反应结果既可以利用肉眼观察颜色的变化或琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的有无来判定。具有操作简便、快速、特异性强等特点。本发明根据GenBank公布的EHV1和EHV4的gB基因核酸序列，设计马疱疹病毒1/4型的Lamp引物，建立了EHV1/4的Lamp分型检测方法。本发明所建立的分型Lamp检测方法能够在核酸水平区分EHV1和EHV4型，该方法的建立为马疱疹病毒的快速诊断和分型检测提供了参考依据，对马鼻肺炎的监测及防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对马疱疹病毒1型和4型分型鉴定的问题，提供一种简便、快速、特异性强、操作简单、结果易于判定的马疱疹病毒核酸分型的Lamp检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的；

1.引物的设计

根据马疱疹病毒1型和4型马疱疹病毒序列进行比对，选取gB区段进行引物设计。利用在线软件Primer Explorer V4software(http://primerexplorer.jp)设计Lamp引物（包括外引物和内引物）见表1。检测EHV1环介导等温扩增反应引物，由一对外引物和一对内引物组成，其中外引物由EHV1FIP和EHV1BIP组成；内引物由EHV1F3和EHV1B3组成；检测EHV4环介导等温扩增反应引物，由一对外引物和一对内引物组成，其中外引物由EHV4FIP和EHV4BIP组成；内引物由EHV4F3和EHV4B3组成。

 

表1 检测马疱疹病毒1/4的Lamp引物的名称和序列

2.病毒细胞的培养

将长成单层的马皮肤细胞分别接种EHV1(438/77)和EHV4(405/76)毒 株（美国模式菌种收集中心购买），加入含40 ml/L胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM生长液适量，37℃静置培养。待细胞病变（CPE）达85%以上即可收获病毒，并反复冻融3次。取适量病毒悬液于8000×g离心30min，收集上清液；然后将收集的上清液以10⁵ｇ离心3h，收集的沉淀用1mL的1×PBS悬起；将预先制备好的200,400,600g/L 的蔗糖溶液按照体积比2:1:1 的比例加入离心管中，最后将收集的沉淀悬液缓慢加到液面上方，动作要缓慢。以10⁵ｇ离心3h，收集在400g/L和600g/L蔗糖层之间的沉淀。将沉淀用适量1×PBS悬起，用1×PBS进行脱糖，10⁵ｇ离心3h，获得的沉淀即为纯化的病毒。将病毒溶于1.5 mL 的1×PBS中，-20℃保存备用。

3． 病毒DNA的提取