[发明专利]一种新型双水相高速逆流色谱

说明书

技术领域

本发明为一种新型双水相高速逆流色谱，将亲水性醇或酮、无机盐和水组成的双水相溶剂体系的一相作为固定相，另一相作为流动相，通过J-型螺旋管高速逆流色谱仪实现强极性化合物的分离。

背景技术

众所周知，水煎汤剂是中药临床应用最广泛的剂型之一，其药效物质的主体必定由大量强极性组分构成，事实也证明了强极性化合物对人体的健康发挥着重要的作用。然而，中药物质基础研究更多的关注弱极性和中等极性化合物，对强极性化合物较少涉足。对这些强极性组分的物质基础及药理药效的研究将会开辟一片新的中药研究领域，其中物质基础研究又是后续研究的必要保证。但强极性中药组分的分离一直是中药物质基础研究的难点，这主要是因为强极性中药药效物质从前期的萃取富集到单体化合物的分离制备存在诸多问题，首先，大多数中药材的传统前处理过程为有机溶剂萃取，以达到药效物质初步富集的目的，但有机溶剂极性有限，致使大量的强极性化合物在萃取步骤中已部分或完全损失；再者，强极性化合物的分子结构中大多含有羧基、磺酸基、氨基、糖基等极性基团，这些基团的存在大大增加了化合物的亲水性和不稳定性使其在常规的反相色谱柱上保留很弱，甚至没有保留。目前的色谱分离方法还不能实现强极性化合物的良好分离。

高速逆流色谱（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一种成功的液/液分配色谱，广泛应用于中药药效物质的分离制备。但一直以来，受到有机/水两相溶剂体系极性的限制，高速逆流色谱更多的适用于非极性和中等极性化合物的分离，即使是极性最强的正丁醇-乙酸-水体系仍然不能满足大多数强极性中药药效物质的分离需要。为满足强极性中药药效物质分离纯化的需要，目前国内外，除研制新型逆流色谱仪外，研究最为活跃的有两个方向，一是在传统有机/水两相溶剂体系基础上发展新的洗脱方法，如正相和反相洗脱、双转向洗脱、梯度洗脱（pH梯度、极性梯度）等，在一定程度上解决了强极性中药药效物质的分离问题。二是新型溶剂体系的提出，包括pH区带体系（pH-Zone system）、离子对体系（Ion pair system）、双水相体系（Aqueous two-phase system）、三相体系（Three phase system）、液/液/固三相体系（Liquid/liquid/solid three-phase system）和离子液体体系（Ionic liquid system）等亲水溶剂体系以适用于强极性中药药效物质的分离。但目前发展的新型溶剂体系大多数都需要在特制的逆流色谱仪中运行，尚无法实现普及应用。

1990年，Greve和Kula首次报道了由亲水性醇、水和无机盐组成的新型双水相体系，该体系与传统的双水相体系相比，具有极性更强，黏度更低、且廉价、环保等优点。尽管新型双水相溶剂体系在国内外的研究才刚刚起步，但在强极性中药药效物质和化工产品的萃取富集及蛋白质、多糖等杂质的除去方面已表现出广阔的研究价值和应用空间。如谭天伟院士在国内首先报道了应用乙醇/磷酸盐体系萃取甘草中的甘草酸钾（biotechnology Letter24(2002)1417-1420）；修志龙教授将该体系成功应用于发酵液中1，3-丙二醇等化工产品的萃取分离（Separation and Purification Technology66(2009)472-478）。然而面对组成复杂的中药提取物，仅利用单级，甚至多级萃取均无法实现目标化合物的单体制备，将新型双水相体系应用于目前广泛应用的高速逆流色谱技术中有望解决这一难题。

发明内容

本发明的目的在于突破有机/水两相溶剂体系高速逆流色谱技术分离强极性中药药效物质时，溶剂体系极性低，分离度差、回收率低、保留时间长等制备问题，提供一种采用新型双水相溶剂体系的高速逆流色谱新方法。

本发明的技术方案：

一种新型双水相高速逆流色谱：是将醇水双相新型双水相溶剂体系的一相作为固定相，另一相作为流动相应用于高速逆流色谱，所述的新型双水相溶剂体系由中等极性有机溶剂、亲水性醇或酮、无机盐和水组成。

所述的高速逆流色谱仪为J-型半制备高速逆流色谱仪，配备三个串联的螺旋管柱，柱体积210mL，螺旋管自转半径和公转半径之比（β值）0.5-0.8。

所述新型双水相溶剂体系中的中等极性有机溶剂为正丁醇，亲水性醇或酮为乙醇，无机盐为饱和硫酸铵和水组成，它们的体积比在（0-10）：（1-10）：10：10（V：V）的范围内配制。

所述新型双水相体系配置温度和分配系数测定温度一致，为30-40℃。