[发明专利]一种氧连接氮乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰糖蛋白质及糖肽的化学衍生方法

说明书

本发明涉及氧连接氮乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰糖蛋白质及糖肽的化学衍生。具体地说是利用高碘酸钠氧化修饰的氮乙酰葡糖胺形成醛基，利用吉拉德试剂上的酰阱基团使该类糖蛋白质及糖肽衍生上季铵盐基团。 

背景技术

氧连接氮乙酰葡糖胺修饰是一种发生在蛋白质丝氨酸及苏氨酸残基上的翻译后修饰，是一种真核细胞内重要的单糖翻译后修饰，在细胞内信号通路中扮演重要作用。然而，该种翻译后修饰的糖蛋白糖蛋白质的研究与其他糖蛋白质研究面临相同的难点：丰度低、糖肽占总肽段比例小，易被高丰度的非糖肽掩盖，质谱信号响应低等。另外作为单糖修饰它也具有其独有的研究难点：修饰基团小，对整体修饰糖蛋白或糖肽的理化性质影响小，无法使用其他糖蛋白的富集手段以降低非修饰蛋白质的干扰。 

文献报道中对该种糖蛋白质常用的研究方法主要有酶促衍生富集法和凝集素亲和法。另外最近有文献（Journal of Proteome Research 2010,9,2200–2206）报道了一种利用高碘酸钠氧化氮乙酰葡糖胺形成醛基，利用酰阱凝胶富集研究该种糖蛋白的工作，该工作开发了利用化学手段研究氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的手段，相较昂贵的酶促衍 生手段，为廉价大规模研究氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质提供可能。 

在蛋白质或肽段上衍生上季铵盐基团在增强样品质谱信号，改变样品电荷等方面有着广泛的应用。因此，鉴于氧连接氮乙酰葡糖胺的修饰会抑制蛋白及肽的质谱响应信号，我们通过季铵盐基团的修饰能有效地提高质谱信号，为后续的质谱分析研究提供帮助。同时由于非修饰蛋白及肽段的干扰，季铵盐基团的加入改变了该种糖蛋白质及肽段的电荷性质。 

发明内容

衍生上季铵盐基团能够增强样品质谱信号，改变样品电荷。本发明的目的是提供一种氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽的化学衍生上季铵盐基团，从而提高该糖蛋白质及糖肽质谱信号，改善其离子交换色谱分离能力。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

以高碘酸钠作氧化剂，对修饰的氮乙酰葡糖胺基团上的邻位羟基进行开环反应形成两个醛基基团，利用吉拉德试剂上的酰阱和新生成的醛基反应，从而糖蛋白质及糖肽化学衍生上季铵盐基团。 

所述氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽的化学衍生方法，具体步骤如下： 

（1）氮乙酰葡糖胺基团氧化：在pH=5-6的30-100mM乙酸钠缓冲溶液中，氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质或糖肽样品与浓度为20-30mM高碘酸钠溶液反应；反应温度35-40℃，反应时间4-8小时。氧化反应结束后，加入4-6倍于高碘酸钠摩尔量亚硫酸钠，反应 10-40分钟，终止氧化反应。对于糖肽而言，采用甲醛二甲基化方法封闭N末端氨基，每100μg肽段加入1-4%甲醛溶液10-25μl，0.15-0.6mM氰基硼氢化钠10-25μl，反应0.5-2小时，反相除盐去除甲醛和氰基硼氢化钠。 

（2）吉拉德试剂衍生反应：将经过高碘酸钠氧化的糖蛋白质样品于浓度为10-100mM的吉拉德试剂混合，反应1-6小时。反应过程在pH=5-6的30-100mM乙酸钠溶液中进行。 

（3）采用反相液相色谱分离除去未反应吉拉德试剂：采用反相C18或C8色谱住，流动相A：2%乙腈，98%水及0.1%三氟乙酸。流动相B：98%乙腈，2%水及0.1%三氟乙酸。采用2%流动相B上样，之后用上样缓冲液冲洗色谱柱5-15分钟，之后用80%流动相将糖蛋白质或糖肽样品洗脱下来，冷冻干燥。 

衍生后的样品用于后续色谱分析及质谱分析。 

本发明具有如下优点： 

1.本发明在氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽上衍生季铵盐基团，增强样品质谱信号，改善分离能力。 

2.本发明采用酰肼和醛基的反应，反应效率高，副反应少。 

3.本发明衍生的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽，保留了部分原氮乙酰葡糖胺的基团，为后续质谱解谱分析提供信息。 

4.本发明利用化学方法衍生的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽，更加廉价，有利于大量大规模样品分析。 

附图说明

图1氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽化学衍生流程图 

图2氧连接氮乙酰葡糖胺修饰标肽TAPTSgTIAPG衍生后MALDI质谱 

图3标肽TAPTSgTIAPG衍生前后质谱信号增强幅度比较图a)MALDI衍生肽段与未衍生肽段1：5混合。b)LTQ衍生肽段与未衍生肽段1：1混合 

具体实施方式