[发明专利]利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵生产有机酸的技术领域，尤其涉及一种利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术

L-乳酸（L-lactic acid）是在微生物发酵过程中通过L-乳酸脱氢酶的催化作用将丙酮酸转换成的左旋乳酸。与D-乳酸相比，由于Ｌ-乳酸可被人体直接吸收，且无任何副作用，所以被广泛应用于食品、医药、化工等领域。

目前发酵产L-乳酸的微生物主要是乳酸菌和根霉菌，乳酸菌对营养成分要求高，而且是兼性厌氧型微生物，发酵过程中不好控制，生产的L-乳酸光学纯度也不高。传统发酵多采用游离细胞发酵方式，游离发酵中，真菌菌丝比较发达，经常出现凝块和结团现象，悬浮的菌丝体还会增加发酵液的粘度，减少了细胞间的氧气传递，降低了乳酸的产量，而且对后续的分离过程也有影响，分离难度大，得到的产物少。

生产成本是制约L-乳酸应用的关键因素之一。工业化生产都采用淀粉质原料，这大大增加了生产成本。而一些廉价可再生的原料，如生物质原料，含有丰富的碳水化合物，可用于L-乳酸的生产。我国是农业大国，每年产生上亿吨的农林废弃物，但是只有极少数被有效地利用，大部分被作为废弃物丢掉。这不仅浪费了丰富的可再生资源，而且也污染了环境。因此，若能利用这些生物质纤维素来生产L-乳酸等各类高附加值产品，走“变废为宝”的路线，应用前景将非常广阔。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种生产成本低、发酵周期短、工艺简单可控、产品纯度高的利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，以蔗渣为原料，通过原料预处理、纤维素酶解，以霉菌为发酵菌种，以蔗渣纤维素的酶解液为碳源，游离细胞发酵或固定化细胞发酵生产L-乳酸。

原料预处理按以下操作进行：用粉碎机粉碎蔗渣，过20-40目筛；精确称取过筛后的蔗渣30g，按料液比为1:30加入质量浓度为0.6-0.8%的H₂O₂和3-5%的NaOH混合溶液，于85℃下搅拌3-5h；抽滤，用蒸馏水洗涤至滤液为中性，残渣于105℃干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎机粉碎，过20-40目筛，收集备用。

纤维素酶解按以下操作进行：精确称取预处理后的蔗渣，按每g蔗渣加入浓度为10mg/mL的纤维素酶液4-8mL，底物浓度28-66g/L，pH4.0-5.4的柠檬酸缓冲溶液17-21mL，于45-55℃、转速120r/min的恒温水浴锅中酶解36-60h，然后煮沸灭酶活，离心分离，回收酶解液备用，测定酶解液中的还原糖含量。

上述利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，采用游离细胞发酵方式，按以下操作进行：

<1>斜面培养：将菌种米根霉（Gim3.129）接入灭菌的试管PDA培养基中，于28℃培养4-6天，后于4℃冰箱中保存；

<2>孢子悬浮液：取一支已培养好的斜面菌种，用无菌生理盐水将斜面上的孢子洗下，于灭菌的三角瓶中，加入无菌的玻璃珠充分打散，用灭菌的脱脂棉过滤，用无菌水冲洗滤渣，使滤液体积为30mL，稀释至孢子悬浮液含1×10⁷个孢子/mL；

<3>种子培养：将孢子悬浮液按4%的接种量接入到装液量为20-70mL的三角瓶中，于28-32℃、200r/min下培养12-24h，制成种子培养液；

<4>发酵培养：将种子培养液按10-14%的接种量接入到装液量为50mL的三角瓶中，30℃、180-200r/min下，发酵36-72h，得到含发酵产物L-乳酸的发酵液；发酵结束后，对发酵液进行抽滤，取清液，按EDTA法测定L-乳酸的浓度，计算L-乳酸的转化率（L-乳酸的转化率=（L-乳酸的浓度/还原糖的浓度）×100%）。

斜面培养基按以下配制：马铃薯200g，加水1000mL，葡萄糖15-25g，琼脂15-25g，加热溶解分装试管，121℃灭菌20min；

种子培养基按以下配制：葡萄糖为50-70g/L，酵母膏（氮源）5-7g/L，KH₂PO₄0.3-0.5g/L，MgSO₄.7H₂O0.2-0.4g/L，ZnSO₄.7H₂O0.08g/L，CaCO₃10g/L，121℃灭菌20min，CaCO₃分开灭菌。