[发明专利]一种用于诱导表达锌指核酸酶的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种用于诱导表达锌指核酸酶的载体及其应用。

背景技术

基因打靶技术是20世纪80年代后期发展起来的一种在高等动物中精细修饰特定基因位点的技术。传统的同源重组（Homologous recombination，HR）介导的基因打靶方法效率低，大约只有1/10⁶。锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）技术是近几年发展起来的一门新型基因打靶技术。ZFNs是一种人工构建的杂合分子，由一个与靶DNA序列特异性结合的多聚锌指结构域和一个切割DNA分子的核酸酶（Fol kⅠ）结构域构成。DNA结合域使ZFN可以与特定DNA序列结合，核酸酶结构域可以将DNA双链切开。因此，ZFN可以在特定DNA区域切断DNA，之后通过诱导同源重组（Homologous recombination,HR）或者非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）使特定基因位点产生突变，而使生物基因组发生遗传改变。

与传统的同源重组基因打靶相比，ZFNs具有效率高，特异性强，适用物种广泛等优点，因此在动植物遗传修饰及医学中具有极其广阔的应用前景。

虽然ZFNs具有打靶效率高的优点，但是目前的ZFNs技术体系对细胞的转染效率有很高的要求。主要表现在：1）ZFNs导入细胞的主要方法是通过转染ZFNs mRNA或ZFNs质粒DNA，这些方法都是在细胞内瞬时表达ZFNs，无法对转染后的细胞进行药物筛选，故需要大量分离和培养单细胞克隆以鉴定出发生中靶的细胞，在操作上极为不便，费时费力；2）功能性ZFNs是由一对质粒组成，故需要同时转染两个质粒或其mRNA，对转染效率有一定影响；3）如果是稳定转染ZFNs质粒，ZFNs在细胞中持续表达，会对细胞产生脱靶毒性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于诱导表达锌指核酸酶的载体。

本发明所提供的一个用于诱导表达锌指核酸酶的载体为环形载体。

所述环形载体，含有大肠杆菌复制起始区（Col E1ori）、氨苄青霉素抗性基因（Amp^r），以及表达盒1、表达盒2、表达盒3和表达盒4；

所述表达盒1从上游到下游依次包括如下元件：P_CMV IE、Puro^r和SV40polyA；所述表达盒2从上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA；所述表达盒3从上游到下游依次包括如下元件：TRE_mod、P_minCMV、DNA片段1和SV40polyA；所述表达盒4从上游到下游依次包括如下元件：TRE_mod、P_minCMV、DNA片段2和SV40polyA；

当所述表达盒3和所述表达盒4相邻且方向相反时，所述表达盒3中的所述TRE_mod和所述表达盒4中的所述TRE_mod可为同一个TRE_mod，此时，所述表达盒3和所述表达盒4中的两个方向相反的P_minCMV和位于两个所述P_minCMV之间的共用的所述TRE_mod构成P_tight元件。

所述DNA片段1和所述DNA片段2满足如下条件：所述DNA片段1编码的蛋白和所述DNA片段2编码的蛋白均含有能够与所述靶基因特异性结合的锌指结构域，以及能够切割所述靶基因的Fol kⅠ结构域。

四个表达盒中，表达盒3和表达盒4的表达可诱导性依赖于TRE_mod元件，由强力霉素结合到TRE_mod元件上诱导表达盒3和4的表达。其它表达盒之间相互独立，方向可以不一样。

在所述环形载体A中，所述大肠杆菌复制起始区（Col E1ori）的序列为序列表中序列1的第8632-9231位；所述氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）的序列为序列表中序列1的第10323-9393位；