[发明专利]一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物

说明书

技术领域

本发明提供一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物，具有促进骨髓受损后的恢复和再生的功能，属于生物制药技术领域。

背景技术

现在，放射治疗和化学药物治疗仍是治疗肿瘤和防止肿瘤复发的主要手段，其主要毒、副作用之一是损伤患者的骨髓系统，造成骨髓造血和免疫功能抑制，导致患者出现贫血、出血、感染、甚至危及生命的现象，严重影响了疗效，经常导致治疗的失败。因此，如何能有效的促进肿瘤患者自身骨髓的造血功能恢复、再生具有非常重要的意义。

放、化疗对骨髓造成的损伤包括造血干细胞和由骨髓间充质细胞组成的造血微环境。目前已经上市的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、和白介素-11（IL-11）等药物都具有很大的局限性，其靶细胞主要是已经定向分化的造血祖细胞，而不是作为造血源头细胞的造血干细胞。这些药物只作用于增生期的造血祖细胞，只能暂时性提高血细胞数量，如果骨髓造血干细胞和造血微环境长期得不到改善，不但无效，还可能加速骨髓造血功能的衰竭。目前，临床上还没有用于促进造血干细胞自我更新和促进受损骨髓间充质细胞再生修复的药物。

造血干细胞是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的原始造血细胞，具备高度的自我更新能力，可分化生成所有类型的血细胞。单个造血干细胞就可以重建个体的造血系统和免疫系统，这种巨大的造血重建潜能每年能挽救45000人的生命。

本发明涉及的“Endomucin”为造血干细胞膜表面的一个受体蛋白分子。在国内外，Endomucin在骨髓造血的功能方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明公开了一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物，其目的是提出作为造血干细胞膜表面的受体蛋白的Endomucin，在放、化疗骨髓的恢复、再生过程中的抑制功能，进而制备能够促进骨髓再生的Endomucin单克隆抗体药物。

本发明提供了Endomucin在制备促进骨髓再生的抗体药物中的用途。

本发明进一步公开了促进骨髓再生的Endomucin抗体药物，其特征在于：

无色透明溶液的剂型，每支Endomucin抗体剂量为20mg/mL,含140mM NaCl,0.5mM EDTA，pH7.4。

本发明公开了促进骨髓再生的Endomucin抗体药物的制备方法，包括以下步骤：

1）Endomucin基因的克隆、蛋白表达与纯化

采用基因合成的方法制备人Endomucin基因，将人Endomucin全长基因分别克隆到pGEX-2T载体中，使目的基因接到谷胱苷肽巯基转移酶（GST）基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达；然后应用anti-GST的亲和层析介质Glutathione –Sepharose对GST-Endomucin融合蛋白进行纯化，采用凝血酶切下GST肽段，获得纯度超过98%的人Endomucin蛋白；

2）Endomucin单克隆抗体的制备与纯化

①抗原免疫：选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案，每次将0.5mL，20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞；

②细胞融合：在免疫结束后的第14天，采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备10mL脾细胞悬液；将准备好的SP20骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合剂聚乙二醇；使各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；