[发明专利]两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生化制药领域，具体涉及两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺。

背景技术

异槲皮苷是一种具有抗肿瘤、抗氧化和降血糖等多种优良药理活性的天然黄酮类化合物（Joμrnal of Ethnopharmacology,2011,134,363-372），但其在天然产物中含量极低，化学合成复杂且成本高，因此获得困难导致价格昂贵，远远无法满足市场需求(CN102827220A)。近年来，以价格低廉的芦丁为底物，经酶法选择性水解获得异槲皮苷，为异槲皮苷的生产提供了新的思路。

专利CN101985639A公开了一种利用α-L-鼠李糖苷酶定向水解芦丁合成异槲皮苷的方法，反应48h后得率为86%。然而反应时间过长，底物浓度过低，不利于工业化生产。本课题组在离子液体共溶剂体系中，用橙皮苷酶水解芦丁产异槲皮苷，反应10h转化率就可达93.4%，离子液体共溶剂体系这种新型的反应体系不仅大大的提高了水解速率，同时也提高了底物浓度10倍（Bioresoμrce.Technology,2013,128,156-163）；但是该体系仍然存在着反应时间偏长、产物对底物有抑制、后期生物分离纯化成本高等缺点。因此，急需寻找一种新的反应体系及技术来更加高效、低廉的制备高纯度的异槲皮苷。

目前，两相催化体系为解决均相体系中的存在的问题，如产物对酶的抑制、反应速率低、催化剂与产物难分离等，提供了一条新的有效途径。通常，使用的两相体系是水相/有机相，酶和底物都溶解在水相中并在其中进行反应，反应生成的产物被实时转移到有机相中，可以实现反应与分离耦合一体化过程。Wang等报道了在“水/环己醇”两相体系中酶促合成环己糖苷，在反应的同时，产物同时转移到萃取相中，消除了底物的抑制作用，提高了产物的得率（Joμrnal of Molecμlar Catalysis B:Enzymatic,2009,56,131-135）；Braun等报道了在“水/油酸乙酯”两相体系中进行生物转化类固醇，与单纯的水相相比，提高了催化剂的稳定性和产物的得率（Microbial cell factories,2012,11,106-118）。然而，目前尚未见到利用两相体系来酶促水解芦丁合成异槲皮苷的报道。

近年来，微反应器由于其优异的传质特性加速反应过程而在生物催化中受到国内外的广泛关注（Chemical Engineering Joμrnal,2013,223,497-506）。在微反应器中进行两相反应建立分段流体系，其优点是两种互不相溶的液体之间的界面面积增大，界面液滴的中心的扩散距离缩短。此外，在液滴内部存在内部循环，近一步增加了界面质量和热量的传递，促进了酶促反应的发生。Tμsˇek等在Y型微反应器中建立了“水-正己烷”两相体系来酶促催化己醇氧化，反应速率比传统的间歇式反应器提高了33倍（Engineering in Life Sciences,2012,12,49-56）。然而，目前尚未见到利用分段流微反应器来酶促水解芦丁合成异槲皮苷的报道。

本专利利用“缓冲溶液-离子液体共溶剂/三乙酸甘油酯”两相体系来酶促合成异槲皮苷的工艺及微反应器技术。该方法操作简便，反应效率高，易于大量制备高纯度异槲皮苷，为推动其在医药工业中的广泛应用具有十分重要的意义。

发明内容

技术问题：

为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的提供了一种两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，以解决反应中底物对酶的抑制作用，缩短时间，提高酶促反应效率，降低生产成本。

技术方案：两相体系中酶促合成异槲皮苷的分段流微反应工艺，将芦丁溶于pH3～10的甘氨酸-氢氧化钠或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，分别加入上述溶液体积10%的离子液体[Bmim][BF₄]和橙皮苷酶构成芦丁反应液，分别将芦丁反应液和萃取液三乙酸甘油酯通过微量注射泵输入到微反应器的微管道中，芦丁反应液中的芦丁浓度范围为0.0036g/L-3.6g/L，反应液中橙皮苷酶浓度范围为0.09g/L-1.8g/L，反应温度范围为20～60℃，芦丁反应液流速范围为2μL/min～20μL/min，萃取液流速范围为2μL/min～80μL/min，进行酶促水解芦丁制备异槲皮苷。

替代方案之一，用间歇式反应器替换微反应器。所述的间歇式反应器为10mL的离心管，放入摇床中进行反应。