[发明专利]光子计数型多通道时间分辨荧光免疫分析系统及计数方法

权利要求书

1.一种光子计数型多通道时间分辨荧光免疫分析系统，包括光源模块、检测模块以及时间标刻光子计数分析/控制模块； 

所述光源模块包括LED（2）以及调制器（1）； 

所述检测模块包括第一光纤准直器（3）、光波分复用器（4）、第二光纤准直器（5）、光开关（6）、光纤探头（7）、暗箱（8）、多孔样品板（9）、滤光片（10）以及PMT光子计数头（11），多孔样品板（9）置于暗箱（8）内，光纤探头为多根，每根探头穿过暗箱上的孔，然后悬空置于多孔样品板的相对应的每个孔的上方； 

所述时间标刻光子计数分析/控制模块包括控制器（12）及上位计算机（13）； 

控制器（12）在接收到上位计算机（13）的命令后，产生触发脉冲的电信号发送给调制器，调制器产生的调制信号控制LED发出激发光脉冲； 

LED（2）发出的激发光脉冲依次经过第一光纤准直器（3）、光波分复用器（4）、第二光纤准直器（5）及光开关（6）的选通的测量通道后输出至某根光纤探头（7）； 

多孔样品板（8）中样品受激发产生的荧光信号由光纤探头（7）接收后，经由光开关（6）按原路返回至光波分复用器（4），再经过滤光片（10）滤光后被送入PMT光子计数头（11），PMT光子计数头（11）输出的信号被送入控制器（12），控制器（12）将计数结果传入上位计算机（13）。 

2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析系统，其特征在于，LED（2）的中心波长为365nm，经调制后的激发光脉冲半峰宽为50μs，并通过耦合光纤实现激发光脉冲的输出；所述光波分复用器（4）的中部固定有截止波长为505nm的二向色镜，对365nm激发光反射率大于95%，对610nm荧光透射率大于97%；所述第一光纤准直器（3）于405nm处具有最大透过率，第二光纤准直器（5）于350～700nm波长区间反射率小于1%。 

3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析系统，其特征在于，所述PMT光子计数头（11）应当至少具有70ns的光脉冲分辨率以及1.5×10⁶s^-1的线性光子计数范围，且能够确保将探测到的光子脉冲信号以TTL电平信号输出。 

4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析系统，其特征在于，所述光纤探头（7）使用芯径为500μm，数值孔径为0.37的石英光纤，且光纤探头探测端具有直径为3mm的金属包覆。 

5.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫分析系统，其特征在于，所述滤光片（10）采用截止波长为510nm的长通滤光片。 

6.权利要求1所述的系统采用的计数方法，其特征在于，脉冲光激发待测样品，样品受激发产生的荧光信号送入PMT光子计数头后输出的脉冲信号的计数方法如下：将激发脉冲光的周期作为计数周期，将每个计数周期划分为多个宽度相同的时间间隔，称为“时窗”，且将该时间间隔称为“时窗宽度”，存储时采用与时窗个数相同的存储器；在每个计数周期里，将该周期的激发光脉冲发送之后检测到的每个光子累加至相应的时窗所对应的存储器中，亦即利用时窗所在区间标刻每个光子在该脉冲周期中的位置，多个周期的计数之后，将上述存储器中的数据传入上位计算机中，对所测得的光子数时间扩展曲线的某个特定区间进行积分以及非线性最小二乘拟合，以分别获得荧光强度和荧光寿命。 

7.根据权利要求6所述的计数方法，其特征在于，对所述的PMT光子计数头输出的脉冲信号计数的方法分为三部分：初始化过程、光子计数过程、数据分析过程，其中： 

初始化过程：通过上位计算机将测量参数发送至控制器中；测量参数包括时窗个数；时钟计数器的计数阈值；激发光脉冲数，控制器根据所设定测量参数，分配与时窗个数相同的存储器； 

光子计数过程：该过程共有5个步骤，具体如下： 

①当控制器产生触发脉冲的电信号时，将该脉冲信号的下降沿作为新计数周期的计数同步信号，此时将时钟计数器与预累加器清零，并将存储地址复位到首个时窗对应的存储器位置； 

②时钟计数器开始计数，并启动预累加器，对PMT探测到的荧光信号进行光子脉冲触发的异步预累加，在预累加器的计数过程中，同步读取当前存储地址下存储器数据； 

③当时钟计数器到达所设定的计数阈值时，认为到达所需的时窗宽度，此时将从存储器中读取的数据与预累加器中的计数结果相加，将相加得到的结果写入当前存储地址以更新该存储位置的光子计数值；存储地址加1，切换到下一时窗存储位置，产生时窗切换信号，并将预累加器及时钟计数器清零； 

④重复步骤②③直到该激发光脉冲的单计数周期中所设定数目的时窗均计数完毕；此时单周期测量结束； 

⑤重复步骤①②③④，进行多周期重复测量，直至完成所设定激发脉冲数的周期的测量； 

数据分析过程：将上述存储器中的数据传入上位计算机（13）中，对所测得的光子数时间扩展曲线的某个特定区间进行积分以及非线性最小二乘拟合，以分别获得荧光强度和荧光寿命。