[发明专利]一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法。

背景技术

硫酸角质素(KS)是糖胺聚糖的一种，该类多糖由不同硫酸化修饰的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和D-半乳糖(Gal)二糖重复单元组成，骨架连接方式是-[3Ga1β1→4GlcNAcβ1]_n-，KS以蛋白多糖形成存在于动物的角膜、椎间板、软骨和动脉中，研究发现，KS在胎儿时期的软骨多糖中含量很低，但是伴随年龄的增长其含量逐渐上升。KS具有抗炎症、抗过敏、免疫调节、细胞的分化诱导、细胞凋亡诱导等生物活性。

KS大量存在于鲨鱼等软骨鱼类和鲸鱼、牛等哺乳动物的软骨和角膜等中，KS通常与硫酸软骨素(CS)混合存在但二者含量不同，如牛等哺乳动物软骨提取物中CS含量很高，而鲨鱼等软骨类糖胺聚糖中KS含量较高，要想检测糖胺聚糖中KS的结构和含量，就要对KS进行分离纯化，然后完全降解为二糖，再对二糖进行检测。目前获得KS二糖的常用方法为酶解法，所用的酶有硫酸角质素降解酶II或β半乳糖苷酶，但是这两种酶价格昂贵，而且不能将KS完全降解为二糖，对于糖胺聚糖中混有KS的样品，酶解法只能用多种酶对不同的糖胺聚糖逐一降解分析，这种降解和检测方法不仅耗时长，而且很难实现完全降解。现有的方法不能满足当前结构分析的需要，因此，亟需找到一种简便、高效、准确度高的检测方法。

发明内容

针对以上现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法，通过该方法可以较为准确地得到CS混合样品中KS的结构信息，并实现对KS定性以及定量分析。实现上述发明的技术方法是：

1.一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法，包括如下步骤：

(1)检测硫酸软骨素混合物中的硫酸角质素

①将硫酸软骨素混合物脱乙酰反应，得硫酸软骨素混合物脱乙酰产物；

②用亚硝酸降解步骤①所得脱乙酰产物，得硫酸软骨素混合物二糖；

③将步骤②所得硫酸软骨素混合物二糖浓缩至干并溶解于水，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；

④用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法分析步骤③所得产物；

(2)分离纯化硫酸软骨素混合物中的硫酸角质素

将硫酸软骨素混合物溶于去离子水，配置成浓度为2-5％(W／V)的水溶液，经阴离子交换柱分离，用不同浓度氯化钠水溶液洗脱，收集氯化钠浓度小于1.5mol／L的洗脱液，浓缩、透析、脱盐后冷冻干燥；

(3)检测硫酸角质素的含量

①将纯化后的硫酸角质素脱乙酰反应，得脱乙酰硫酸角质素；

②用亚硝酸降解步骤①所得脱乙酰硫酸角质素，得硫酸角质素二糖；

③将步骤②所得硫酸角质素二糖浓缩至干并溶解于水，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；

④用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法分析步骤③所得产物。

2.一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法，步骤(1)中所述的脱乙酰反应包括如下步骤：

将硫酸软骨素混合物溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄·H₂O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到80-105℃，反应4-16h，反应完成后，冻干，除去N₂H₄得硫酸软骨素混合物脱乙酰产物；

所述的亚硝酸降解包括如下步骤：

将硫酸软骨素混合物脱乙酰产物浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得硫酸软骨素混合物二糖。

3.一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法，步骤(3)中所述的脱乙酰反应包括如下步骤：