[发明专利]一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法

权利要求书

1.一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）滑刃属食真菌线虫的分离：从野外采集新鲜土壤，采用改进的浅盘法从土壤中分离线虫；

（2）滑刃属食真菌线虫的鉴定：根据滑刃属食真菌线虫的特征，在解剖镜下用毛细管挑出该属线虫，再将其在光学显微镜下进行活体鉴定；

（3）滑刃属食真菌线虫的表面消毒：将线虫转入灭菌的离心管中，用硫酸链霉素和放线菌酮混合液对线虫进行表面消毒；

（4）滑刃属食真菌线虫的富集培养：将真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）接种到经灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，采用封口膜将培养皿封口，然后将培养皿倒置放于恒温培养箱内，20-25℃黑暗培养；一周后，待真菌大量繁殖时即将滑刃属线虫接入长满均匀一致灰葡萄孢的培养皿中；培养皿用封口膜封口后，置于灭菌整理箱内，20-25℃黑暗培养，定期观察，直至灰孢基本消失，线虫大量繁殖；重复以上步骤获得大量的滑刃属食真菌线虫；其中，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方为：每1000 ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，琼脂15-20 g，其余为水，pH值自然。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述改进的浅盘法具体如下：将10目的不锈钢筛盘放入配套的浅盘中，在筛盘上放置两层面巾纸，然后把土样均匀铺在纸上，往浅盘中加水直至浸没土壤；再置于20-25℃温度、黑暗条件下分离；48-60 h 后，用400目筛收集线虫于烧杯中；静置过夜后，用真空泵缓慢吸取上层液体，并尽量避免扰动下层液体，此时，下层液体收集到线虫。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述混合液中，硫酸链霉素的质量-体积浓度为0.80-1.20 g.L^-1；放线菌酮的质量-体积浓度为0.015-0.02 g.L^-1；对线虫进行表面消毒的时间为15-20 min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中鉴定滑刃属食真菌线虫，其依据的鉴定特征如下：①热杀死后，雌虫虫体直到腹弯，雄虫通常尾部向腹部弯成钩状整个虫体呈“J”形，活体线虫多呈“S” 形；②头部通常略缢缩，头架骨软化，口针较细，基部膨大，长度通常为10-12 μm，一般不超过20 μm；③食道前体部圆柱形，中食道球发达、卵圆形或者方圆形，中食道球瓣发达，后食道腺叶发达、覆盖肠的背面；④排泄孔位于中食道球后水平处；⑤雌虫尾呈圆锥形，尾端形态多样：钝圆或细圆，指状或分叉或有一腹突，有或无尾尖突，尾尖突的形态多样；⑥雄虫尾呈圆锥形、向腹面弯成钩状；交合刺呈玫瑰刺形，基顶和基喙通常发达，无交合伞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的经灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基是将培养基在高压灭菌锅中，121℃温度下，灭菌30 min得到的。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）富集培养后得到的滑刃属食真菌线虫的保存方法如下：将其置于培养皿中，封口后正面朝上置于4℃冰箱内保存；每隔5-6个月，将滑刃属食真菌线虫继代培养；具体操作过程为，将培养皿从4℃冰箱取出，挑出一小块长有线虫的培养基，放入长满均匀一致灰葡萄孢的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，将培养皿封口后放入灭菌整理箱内，20-25℃黑暗培养，并定期观察，三周后将培养皿至于4℃冰箱内保存。