[发明专利]检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，其特征在于：所述包被酶标板以重组蛋白1024b作为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述重组蛋白1024b具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列的基因编码。

3.根据权利要求2所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被酶标板每孔包被重组蛋白1024b50ng，包被缓冲液采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，并用5%的脱脂奶粉作为封闭液进行封闭。

4.根据权利要求3所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：

所述阴性对照血清和阳性对照血清各2mL；

所述酶标二抗为60mL，由美国Earthox公司生产的山羊抗猪IgG稀释8000倍而得；

所述浓缩洗涤液为10×洗涤液，为含0.5%吐温-20pH7.2-7.4的0.1M的PBS溶液，共200mL；

所述样品稀释液为含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%叠氮钠pH7.2-7.4的0.01M的PBS溶液，共100mL；

所述显色液包括显色液A和显色液B，显色液A：称取200mg四甲基联苯胺，溶于100mL的无水乙醇中，双蒸水定容至1000mL；显色液B：称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75%过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至1000mL，调节PH值为4.5-5.0；显色液A和显色液B均为60mL。

所述终止液为2M的H₂SO₄溶液，共30mL。

5.根据权利要求4所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述重组蛋白1024b按以下操作制备：以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板，PCR扩增猪胞内劳森氏菌外膜蛋白1024的基因并克隆得到克隆质粒pMD-1024；以克隆质粒pMD-1024为模板，扩增1024b并克隆获得克隆质粒pMD-1024b，再将1024b亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中筛选获得原核表达质粒pET32a-OMP1024b；将原核表达质粒pET32a-OMP1024b转化进宿主表达菌BL-21(DE3)中，经IPTG诱导表达获得重组蛋白1024b；利用Ni²⁺亲和层析法纯化重组蛋白1024b，复性后得到具有生物学活性的重组蛋白1024b。