[发明专利]用于培养猪孤雌激活胚及体外受精胚胎的体外培养液

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪体外胚胎培养液，特别涉及一种用于培养猪孤雌激活胚及体外受精胚胎的体外培养液。

背景技术

动物胚胎的体外培养是胚胎生物技术中的重要环节。在体外培养条件下，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程，而停顿在某个特定发育时期，这一现象被称为胚胎体外发育阻断（in vitro block of embryonic development），因而严重影响早期胚胎体外发育质量，如猪体外囊胚发育率一般仅为20%左右，内细胞团数量在3个左右，导致后代的出生率下降，极大地阻碍了猪在农业、生物工程和医学中的研究应用。

动物胚胎的体外培养与三方面的因素有关，即胚胎种类、培养条件和培养液的成分，其中培养液成分的改进是体外培养的技术的基础和关键环节所在，直接影响到体外培养效果和体外生产胚胎的质量。

能量代谢是胚胎在体外发育过程中的基本生命活动，能量物质是胚胎培养液中的重要成分。丙酮酸、乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺等作为能源物质，其作用机理，不同动物有差异。尤其是葡萄糖对早期胚胎培养的作用已证实对小鼠、仓鼠的受精卵有显著的抑制作用，是胚胎克服发育阻断的障碍。猪也有类似的现象，2-细胞和4-细胞的猪体外发育胚胎对葡萄糖的需求低于桑椹胚和囊胚期的胚胎。

氨基酸和维生素是胚胎发育所必需的。氨基酸是蛋白质合成的前提，同时也参与能量代谢，故大多数培养液中含有氨基酸。维生素作为碳水化合物和氨基酸代谢过程中必不可少的成分，能促进细胞对葡萄糖的摄取和乳糖的合成，从而影响胚胎的代谢和发育。在输卵管和子宫液中有20～25种哺乳动物所需要的必需和非必需氨基酸，其中牛磺酸、天门冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸的含量很高。谷氨酰胺可作为小鼠、仓鼠、猪胚胎发育的重要能源物质，对致密化后期的胚胎发育有利，促进胚胎向囊胚发育和胚泡的形成，并增加滋养层细胞的数量和囊胚的孵化能力。

无机盐离子是培养液中不可缺少的组成部分，它不仅是培养液渗透压的主要维持者，而且其本身也直接或间接的参与胚胎代谢过程。哺乳动物输卵管液以高浓度的K⁺为特征。由于胚胎能在较宽的离子浓度范围正常培养，因此寻找培养基的最佳离子组成比较繁杂。在众多无机盐离子中，Mg²⁺是许多酶，特别是糖酵解和三羧酸循环中许多酶的辅酶，在能量代谢中可能起到重要作用；Ca²⁺对维持细胞膜的稳定性、通透性以及细胞之间的连接有重要的作用，对桑椹胚的紧缩及囊胚的形成和扩展起至关重要的作用。

血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分，它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。血清的已知成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、生长因子等。胚胎培养时，一般加入牛血清、羊血清、兔血清等，及牛血清白蛋白（BSA）。血清加入有利于胚胎发育，但因厂家、批次不同，培养效果相差甚远。血清来源不同效果不同，牛血清有胎牛血清（FCS）（来源少，价格高）、新生犊牛血清（NCS）（刚产下未哺乳的小牛）、小牛血清（CS）（哺乳后的小牛，含有更复杂的成分）、发情牛血清（OCS）、阉公牛血清（SS）。因此，选择血清也是培养的关键。

在胚胎发育过程中研究较多的生长因子主要为胰岛素样生长因子（IGF-I、IGF-II）和表皮生长因子（EGF）。IGF-I、IGF-II及其受体基因在早期胚胎中均有表达，IGF-I在输卵管及子宫分泌物中存在，IGF-I可以通过改变凋亡相关基因减轻猪孤雌胚体外发育中早期胚胎凋亡的发生。NCSU-23培养液中有或无BSA时添加10或100ng/ml IGF-I并没有明显改善孤雌胚的发育率；然而，在有BSA存在时，IGF-1却增加了囊胚细胞数。EGF是血清和卵泡液中都存在的生长因子，无血清培养液中加入EGF能促进牛胚胎的发育，增加蛋白质的合成和囊胚的孵化率，但不增加囊胚中的细胞数量，有的研究则认为EGF的作用仅表现在促进孵化，也有研究发现EGF也能增加囊胚细胞数量。猪克隆胚胎和体外受精胚在成熟的卵母细胞、桑椹胚和囊胚均有EGF mRNA的表达。而且，EGF的表达量在2-细胞后有减少的趋势，因此可以推测2-细胞后添加EGF有可能促进胚胎发育；同时发现EGFR仅在2-细胞、桑椹胚和囊胚阶段表达，而在4-8细胞内未见表达。可推测，在胚胎不同发育阶段，EGF通过与其受体的相互作用而对胚胎发育产生直接或间接的影响

除上述的常规添加成分外，一些学者也曾尝试过在猪培养液中添加一些其他成分，以提高胚胎卵裂率和囊胚率等。如培养基中加入适当浓度的EDTA-Na₂、20g/L马尾藻类多糖、亚硒酸钠等。