[发明专利]一株产角蛋白酶的金色链霉菌及其应用方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产角蛋白酶的金色链霉菌及其粗酶性质。

背景技术

我国每年产生大量的家禽羽毛和废次羊毛，其主要成分是角蛋白。由于角蛋白存在大量的二硫键、氢键和疏水作用，不容易被普通蛋白酶水解，因而大部分未被利用，有的甚至造成环境污染。角蛋白酶可将家禽羽毛、废次羊毛降解转变为可溶蛋白质、多肽或者氨基酸，用作医药原料、动物饲料等，变废为宝，减少环境污染。许多微生物能产生角蛋白酶，如链霉菌、单胞菌、芽孢杆菌等。

本发明的目的在于提供一株产角蛋白酶的金色链霉菌，并初步研究了其粗酶性质。

发明内容

角蛋白酶产生菌株的筛选、鉴定、培养条件优化等方法如下：

（1）平板初筛：从江南大学附近农村羊圈采集土壤样品，取1g土样添加到10ml生理盐水中，制备土壤悬液，稀释涂布至初筛培养基平皿中， 30℃培养3d。在分离平板上挑取能生长的较大的单菌落，划线分离至单菌落。

（2）摇瓶复筛：初筛得到的菌株经摇瓶发酵，测定其上清液角蛋白酶活力，发现13号菌酶活力较高。

（3）菌株16S rDNA鉴定：提取总DNA，用细菌16S rDNA通用引物扩增，得到的基因序列为1500 bp，经测序比对，为金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)，命名为K13，于2013年8月19日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8047 。

（4）菌株发酵条件初步优化：利用单因素及正交实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化，得到最适培养基配方为羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白胨3-5%，硝酸钠0.3%，磷酸氢二钾0.04%，氯化钠0.05%，摇床培养条件为：初始pH值为10.0，接种量10%，培养温度30℃，摇床转速220r/min，装液量30ml/250ml，发酵周期64h，产角蛋白酶活力达到44.2U/ml。

（5）粗酶性质研究：分别研究了作用温度和作用pH对该酶活力的影响，发现该角蛋白酶的最适作用温度为50-60℃，最适pH 为8.5，且该酶在碱性(pH7.0-10.0)环境中酶活力稳定（±10%）。该酶为中温碱性角蛋白酶。

（6）角蛋白酶活力的测定方法：取一18ml试管，依次加入粗酶液(发酵上清液)1.0ml、0.05mol/l的pH Tris-HCl缓冲液2.0ml、羊毛粉底物10mg，37℃恒温振荡水浴锅反应1h，加入0.4mol/l的三氯乙酸2.0mL终止反应，离心取上清液于280nm测定其吸光值。以37℃恒温振荡前添加三氯乙酸的反应管作对照。

酶活力定义：在上述反应体系中，280nm下的吸光度值增加0.01个单位为1个酶活力单位(U/ml)。

其中步骤（1）中所述的初筛培养基为（g/L）：羊毛粉5，K₂HPO₄ 1，NaCl 0.5，琼脂粉20；步骤（2）中所述的复筛摇瓶发酵培养基为（g/L）：羊毛粉10，K₂HPO₄ 0.4，NaCl 0.5。

    本发明所述的Pseudomonas xanthomarina DN1为反硝化细菌，可广泛应用于各种富营养化水体的净化。 

具体实施方式

实施例1 角蛋白酶产生菌株的筛选与鉴定

1、培养基配方

(1)初筛培养基(g/l)：羊毛粉5，K₂HPO₄ 1，NaCl 0.5，琼脂粉20。

(2)种子液体培养基

高氏培养基(g/l)：可溶性淀粉20，KNO₃ 1，NaCl 0.5，K₂HPO₄ 0.5，M gSO₄^.7H₂O 0.5，

FeSO₄·7 H₂O 0.01。

LB 培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。