[发明专利]一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法及试剂盒

权利要求书

1.一种柑桔衰退病毒的表达载体构建方法，包括以下步骤： 

1）提取病株中柑桔衰退病毒的总RNA； 

2）以上述总RNA为模板，用引物ZYC357/ZYC358扩增启动子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分别扩增柑桔衰退病毒基因组的片段1和片段2，所述的引物核苷酸序列分别为： 

ZYC357：5’-TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA AAGGAGAAGAACT-3’ 

ZYC358：5’-ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA ACAAAGAAATTGAAG A-3’ 

ZYC412：5’-GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3’ 

ZYC415：5’-CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3’ 

ZYC479：5’-CAAAC CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’ 

ZYC480：5’-ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’ 

3）用含有绿色荧光蛋白的质粒和特异引物ZYC349/ZYC350扩增绿色荧光蛋白基因，引物ZYC349/ZYC350序列为： 

ZYC349：5’-AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3’ 

ZYC350：5’-AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3’ 

4）将步骤2、3中获得的启动子、片段1、片段2和绿色荧光蛋白基因的扩 增产物经切胶纯化后，分别与载体进行链接、转化，并对获得的菌液进行质粒纯化； 

5）取步骤4中的纯化后分别含启动子和片段2的质粒混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC358，从而得到35S-127，并进行浓缩；将纯化后分别含片段1和绿色荧光蛋白基因的质粒进行混合，通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC349/415，从而得到35S-126；将浓缩后的35S-126和35S-127混合，再次通过overloop PCR进行连接，正反向引物为ZYC479/ZYC415，从而得到35S-128，并进行浓缩； 

6）取步骤5中所述浓缩后的35S-128与柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148分别进行StuI/PacI双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，进行切胶回收，纯化后的酶切产物混合并进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后从而得到柑桔衰退病毒的表达载体35S-149。