[发明专利]一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法及试剂盒

权利要求书

1.一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，包括以下步骤： 

1）提取柑桔病株中柑桔衰退病毒分离株FS-577的总RNA； 

2）以所述总RNA为模板，用随机引物反转录合成第一链cDNA； 

3）用柑桔衰退病毒分离株FS-577的全序列设计的6对特异性引物，分段扩增所述步骤2中第一链cDNA的6个片段：cDNA片段1～6，所述的特异性引物的核苷酸序列分别为： 

引物1上游引物序列ZYC214： 

5’-CACTCGAGACAAACATCCCTGCCCAACGC-3’； 

引物1下游引物序列ZYC1293： 

5’-GCAGGATCCGTCGTACAGGGATCGTAATTAC-3’； 

引物2上游引物序列ZYC749： 

5’-AGTCCTCGAGAACCACTTAGTTGTTTAGCTATC-3’； 

引物2下游引物序列ZYC1894： 

5’-GCCGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCATAGGGACAGTG-3’； 

引物3上游引物序列ZYC253： 

5’-GTTCCGCATGCAGGAGTAAACACGTAGGTATGT-3’； 

引物3下游引物序列ZYC1436： 

5’-AGCTCCATGGTGGGGAGAAACGGATCTTCAT-3’； 

引物4上游引物序列ZYC126：5’-CTTACTACGCCAACGCGAGCC-3’； 

引物4下游引物序列ZYC1493： 

5’-GAGCCCGCAGGACGCTGTGGAAAGATGCGT-3’； 

引物5上游引物序列ZYC431： 

5’-GGTAGATCTAGCGCGGAACAATTTTTTTCA-3’； 

引物5下游引物序列ZYC1478： 

5’-GCGGCTGCAGCTCGCAACCCGCCAGGA-3’； 

引物6上游引物序列ZYC2158： 

5’-CGAACAGGTTCAATTTGTGAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3’； 

引物6下游引物序列ZYC114：5’-CCGGAATTCAGGCAGCTTGGGAAAT-3’； 

4）将步骤3中扩增得到的cDNA片段1与双元载体pUC119-Δ9分别进行PmeI/PstI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-143；将35S-143与cDNA片段2分别进行PstI/SwaI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-144；将35S-144与cDNA片段3分别进行XmaI/PmeI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-145；将35S-145与cDNA片段4分别进行XmaI/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后得到35S-146；将35S-146与cDNA片段5分别进行Rsr II/Bsu36I双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到35S-147；将35S-147与cDNA片段6分别进行Rsr II/AscI双酶切，双酶切产物经切胶纯化后混合进行链接，链接产物经转化、质粒纯化后，得到柑桔衰退病毒全长侵染性克隆35S-148。 

2.根据权利要求1所述的一种柑桔衰退病毒全长侵染性克隆的构建方法，其特征在于：所述步骤3中PCR扩增的反应条件为94℃2min；94℃30sec，58℃45sec， 72℃，4min循环35次；最后72℃延伸10min，终止反应。