[发明专利]一种检测人肾损伤分子的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫分析技术领域中的一种检测人肾损伤分子的酶联免疫试剂盒。

背景技术

Iehimura等于1998年采用表象差异分析(rep-resentational differenee analysis，RDA)在缺血一再灌注大鼠肾细胞中识别一种新的I型跨膜蛋白，命名为肾损伤分子一1(kidney injury molecule一1，KIM-1)，其大量表达于缺血一再灌注损伤后再生的近曲小管上皮细胞，而在正常肾组织中表达甚微。人类KIM-1基因定位于第5号染色体长臂(5q33.2)，KIM-1蛋白由334个氨基酸残基组成，蛋白结构表明，KIM-1可能属于免疫球蛋白超家族，其胞外区包括1个信号肽、1个Ig域和1个粘蛋白域，执行膜受体/粘附分子的功能。KIM-1胞内区较短。含一个保守的酪氨酸磷酸化位点，可能为转导受体一配体相互作用的细胞内信号转导通路。KIM-1的表达具有极高的组织特异性。RNA印迹杂交分析表明，KIM-1在胎肝、胎肾中不表达，在正常成人肝、肾、脾有微弱表达，而在缺血损伤后的肾组织中表达显著增强。免疫组织化学染色及RNA原位杂交显示，KIM-1mRNA及蛋白分子表达于外髓部外层及皮质髓射线的近曲小管S3区再生上皮细胞中，亚细胞定位大多在基底膜细胞顶部。KIM-1的生物学功能，可能参与肾脏疾病的损伤及修复过程、对抗损伤性粘附与免疫反应过程。

KIM-1在临床上可作为检测急性肾损伤的灵敏、特异、定量的生物学标记物：急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是涉及多学科的一种常见病症，早期发现和及时治疗可防止病情进一步恶化，阻止其发展成肾衰竭。既往传统的血肌酐、尿素氮等指标无法满足AKI的临床早期诊断需要。KIM一1被认为AKI的标志物之一，KIM一1是一种新的I型跨膜糖蛋白，在正常的肾组织中几乎不表达，但在缺血、肾毒性等所致的AKI的肾小管上皮细胞呈高表达，其细胞外域在金属基质蛋白酶(matrixmetallopr-oteinases，MMP)的作用下可裂解为可溶性片段释放到细胞外，并排入尿中。动物研究表明，尿KIM一1的升高早于血肌酐、尿素氮、尿蛋白等指标，当人类发生AKI时，尿KIM-1升高也较明显，但KIM一1能否最终被广大的临床医生所公认并成为早期确诊AKI的灵敏指标，还需在进一步的临床研究中得到证实。

KIM-1还可用于肾肿瘤的早期诊断。已有报道表明，可溶性KIM-1的粘蛋白域可对抗粘附，起细胞保护作用，肿瘤细胞上的粘蛋白过度表达，也可抑制淋巴细胞与肿瘤细胞的粘附，从而保护肿瘤细胞，使其转移成为可能。肾细胞癌细胞株769-P能大量表达KIM-1，肾细胞癌患者肾活检标本通过免疫组化显示，同样高度表达KIM-1，而在肾切除术后，尿KIM-1水平迅速下降或消失，表明KIM-1及其可溶性成分可能在肾肿瘤的发展及转移中起作用，可作为肾肿瘤的早期诊断指标。

基于KIM-1在临床研究和辅助诊断中可能具有的重要作用，准确测定不同尿液样本中的KIM-1水平对于基础及临床研究均具有重要的意义。酶联免疫法由于检测设备要求低，易于实现快速高通量，定量较为准确，因此是目前测定KIM-1的主要手段，本发明完全自主开发出了针对KIM-1不同位点的新型鼠抗KIM-1单克隆抗体，采用双抗夹心法组成了KIM-1检测试剂盒，可以被广泛应用于KIM-1的基础及临床研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、准确性强、低成本的人KIM-1双抗夹心法检测试剂盒。

本发明所提供的检测试剂盒包括特异性的KIM-1包被抗体，酶标KIM-1检测抗体以及人KIM-1蛋白标准品。

其中所述KIM-1包被抗体和检测抗体皆为鼠源单克隆抗体，所述人KIM-1蛋白标准品为真核表达的重组人KIM-1蛋白。

所述单克隆抗体采用重组人KIM-1蛋白免疫动物，利用杂交瘤技术制备获得。酶标抗体按照常规方法利用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记抗体获得。所述重组人KIM-1蛋白是真核表达后纯化获得。

本发明的技术方案为优选针对KIM-1不同表位，具有高灵敏度、高特异性的单克隆抗体配对组合，将一株单克隆抗体作为包被抗体吸附于固相载体上，包被抗体可以特异性的捕获样本中的KIM-1以及KIM-1蛋白标准品，加入酶标检测抗体后，形成包被抗体、抗原、检测抗体复合物，相应底物显色后终止，读取样本吸光值，通过与标准曲线比较即可得出KIM-1的含量。