[发明专利]一种具有示踪性的可降解阿特拉津的质粒、基因工程菌及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及农药降解领域，具体的涉及一种降解阿特拉津的质粒、工程菌及降解方法。

背景技术

生物强化（bioaugmentation）技术被认为是提高难降解污染物生物去除效率的可行和有效途径。采用基因工程菌实施生物强化处理，是提高难降解有机污染物去除效率的有效手段。基因工程菌生物强化可以高效去除难降解污染物，加速处理启动过程，提高处理系统抗冲击的能力，增强微生物群落结构和功能的稳定性。

阿特拉津是世界上用量最大的除草剂，阿特拉津及其代谢产物对于水生生物具有一定的生物毒性，是一种主要的环境污染物。由于阿特拉津生物降解性较差，采用传统生物处理工艺对废水中阿特拉津去除效果不甚理想，因此可采用基因工程菌生物强化提高阿特拉津生物去除效率。

在基因工程菌废水生物强化处理中，基因工程菌在处理系统中的存在状态 (包括降解基因在系统中的存在和分布状态)对于生物强化效果及其稳定性具有重要影响，同时也是生态风险评价的重要依据。但是已知的具有阿特拉津降解能力的菌株，如菌株Arthrobacter sp.AG1、菌株Pseudomonas sp.ADP等均为野生菌株，其阿特拉津降解基因位于野生质粒上，由于野生质粒的存在和表达具有一定的不稳定性，因此，现有菌株在使用过程中，不可避免的存在难以检测和保证菌体降解能力、难以监测和控制生物强化效果的难题。

采用单一的阿特拉津降解基因工程菌进行生物强化，不便于在处理系统中和流失到环境后对基因工程菌进行监测，难以保证生物强化处理的效果，并且难以评价和规避基因工程菌的环境生态风险。

生物强化系统中基因工程菌(包括降解基因) 的原位监测日益受到关注。现代分子生物学技术为生物强化系统中基因工程菌(包括降解基因)的监测提供了有效手段，例如报告基因、分子指纹、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、荧光原位杂交(FISH) 及共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)等技术，可以对基因工程菌(包括降解基因) 在自然及人工生态系统中的存在及迁移情况进行监测。但是针对特定菌株或特定质粒，选取上述监测技术手段，实现快速、简捷、高效的原位实时检测仍然较为困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将阿特拉津降解基因和绿色荧光蛋白基因融合表达于适合载体，从而实现实时检测的具有示踪性的可降解阿特拉津的质粒及其基因工程菌，同时提供一种可实现实时检测的降解阿特拉津的方法。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明将阿特拉津降解基因序列与绿色荧光蛋白核苷酸序列插入到质粒pUC18上得到重组质粒。

本发明所述阿特拉津降解基因序列为atzA基因序列。

本发明所得重组质粒为pUC18-atzA-gfp。

本发明的基因工程菌含有具有示踪性的可降解阿特拉津的质粒，宿主菌为大肠杆菌DH5α。

本发明的降解阿特拉津的方法使用具有示踪性的可降解阿特拉津的基因工程菌进行降解。

本发明的降解阿特拉津的方法所述基因工程菌的接种量为4.0×10⁸~1.0×10⁹ CFU/mL。

本发明所取得的积极效果为：

通过本发明构建的具有示踪性的可降解阿特拉津的质粒，并进一步转化获得具有示踪性的可降解阿特拉津的基因工程菌。本发明通过构建具有阿特拉津降解、绿色荧光蛋白示踪和强水平迁移功能的重组质粒pUC18-atzA-gfp，并利用含有重组质粒的基因工程菌进行阿特拉津生物强化处理，可以促进土著降解细菌的形成和规模扩大，使阿特拉津的生物处理效率稳定在90%左右，同时可以在处理系统和环境中对重组质粒进行原位监测，掌握其基因工程菌和土著降解细菌中的分布和流失情况，有助于评价和防范环境生态风险。

附图说明

图1为pUC18-atzA-gfp重组质粒构建方法的流程图。

图2为质粒pACYC184的质粒图谱及核苷酸序列图。

图3为质粒pUC18的质粒图谱。

图4为质粒pACYC184的凝胶电泳图。

图5为酶切后的质粒pACYC184的凝胶电泳图。

图6为质粒pUC18的凝胶电泳图。

图7为酶切后的质粒pUC18的凝胶电泳图。

图8为pUC18-atzA-gfp重组质粒的凝胶电泳图。

图9为基因工程菌抗生素抗性检测试验结果图。