[发明专利]鸡NK-lysin基因及其克隆方法和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体说是用分子生物学技术获得一种鸡NK-lysin基因。

背景技术

抗菌肽(antibecterial peptide，ABP)是一类具有抵抗外来有害微生物侵袭，消除体内自身突变细胞功能的小分子活性肽，也是生物免疫防御系统在收到外界外源病原体侵染时产生的一类生物非特异性免疫应答产物，其广泛存在于动物的免疫细胞，各种脏器的粘膜，皮肤粘膜及泪腺等。抗菌肽作为生物活性小分子，是一种非专一性的免疫应答产物，具有广谱抗菌的作用，它不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和一些薄包膜病毒有抵抗作用，对寄生性原虫，肿瘤细胞也具有广泛的杀伤作用，却不破坏动物体内的正常细胞，而且有效作用浓度极低。由于抗菌肽除了具有抑制病原微生物，抗肿瘤的作用，而且活性稳定、不易产生耐药性、不污染环境，其研究及应用已成为生物制药领域中的研究热点，成为克服抗生素滥用导致的耐药性问题的优异解决方案。

NK-lysin是机体自然杀伤细胞(NK)和毒性T细胞(CTL)中存在的一种被称之为“颗粒溶素”的抗菌肽，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了重要作用。研究表明，自然杀伤细胞(NK)和毒性T细胞(CTL)在机体免疫防御系统中与中性粒细胞、巨噬细胞一起发挥着至关重要的作用。在病原物的刺激下，这些细胞会释放一些溶细胞颗粒作用于靶细胞，而溶细胞颗粒包含了多种蛋白，它们通过干扰靶细胞膜而导致细胞凋亡，以达到抵御病原菌的作用。1987年，Jongstra等从人的T淋巴细胞中分离一种新基因；2000年，Krensky根据该基因位于NK和CTL，将其命名为granulysin(GNLY，颗粒溶素)，该基因编码的多肽对细菌、真菌、原生动物、寄生虫等具有广泛的抗性。随后，从猪的肠道组织中分离到类似于人的GNLY，且具有抗菌功能，并命名为NK-lysin(NKL)。但是，目前还缺乏关于NK-lysin基因在克隆和表达方面深入的研究。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种来源于鸡的NK-lysin基因，并采用基因重组技术，对NK-lysin基因进行克隆并构建重组质粒pET-32a-NK-lysin转化到宿主菌大肠杆菌Rossetta中进行表达。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

首先，本发明公开了鸡的NK-lysin基因，该基因具有如序列表中所示的序列1(SEQ ID No.1)所示。

具体的，本发明公开了上述基因的克隆方法，所设计的基因PCR扩增引物如下：

上游引物，3’-GTGAAATTCAAGTGCCCCTCA-5’；

下游引物，3’-GCCGGTGCAGTAAATGATGATCTCC-5’。

采用上述引物可以实现NK-lysin基因的克隆，完整的过程如下所示：

首先，从淋巴细胞中提取总RNA，并将上述抽提的淋巴细胞RNA反转录为cDNA；

然后，以cDNA为模板，基于上述引物采用PCR方法扩增NK-lysin基因。

在PCR反应完成后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

进一步的，还包括对PCR产物进行纯化的步骤，可以采用任意可行的试剂盒对上述PCR产物进行回收，优选的是采用OMEGA胶回收试剂盒进行回收，具体的回收操作可参考试剂盒的操作说明书。

作为上述基因的具体应用，本发明公开了上述基因的表达方法，包括如下两种：

1.采用PMD-19T作为载体构建重组质粒pMD-19T-NK-lysin，并转化到宿主菌大肠杆菌DH_5α中进行表达，上述表达的阳性菌经过培养后采用菌落PCR方法，其中的阳性克隆进行序列鉴定。

2.采用pET-32a作为载体在连接酶催化下进行连接反应构建重组表达质粒pET-32a-NK-lysin，并转化到宿主菌大肠杆菌Rossetta中进行表达，上述表达经IPTG诱导后可成功实现蛋白表达。

附图说明

图1为采用RT-PCR方法扩增NK-lysin基因的电泳结果示意图；

图2为克隆pMD19T-NK-lysin及pET-32a双酶切鉴定结果图；

图3为pET-32a-NK-lysin融合蛋白SDS-PAGE电泳结果图；

图4为NK-lysin基因表达蛋白纯化鉴定图。

具体实施方式

在下述描述中，申请人具体描述了本发明NK-lysin基因的克隆方法、鉴定方法和表达方法，仅用于说明本发明的较佳实现。