[发明专利]一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从灵芝的醇提物中分离制备高纯度抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法，特别是涉及一种采用大孔树脂层析和高速逆流色谱二种技术联用，分离制备高纯度抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法。

背景技术

灵芝，别名瑞草、万年蕈等，是一种大型药用真菌，属于担子菌岗多孔菌科灵芝属真菌，包括赤芝Ganoderma lucidum(Levss. ex Fr.)Karst. 和紫芝Ganoderma sinense Zhao. Xu et zhang. 的干燥子实体。具有补中益气、滋阴强壮、扶正固本、延年益寿等功效，历代医书将其列为上品。灵芝三萜类化合物是灵芝中重要的活性成分之一。到目前为止，已成功分离出三萜类化合物150余种，其中大部分是灵芝酸，但是由于它在灵芝中的含量低，且结构相近，分离和纯化工艺复杂，实验室一般采用层析法和色谱法多次分离提纯，这样所得到的高纯度灵芝三萜化合物的量很少且成本较高，难以开展灵芝三萜在药理学、药效学和毒理学等方面的研究，极大影响灵芝三萜的继续开发和利用。因此，研究三萜化合物的大容量分离纯化的技术具有重要的理论意义和实践意义。现代药理研究表明，灵芝酸具有抗肿瘤、保肝、降血糖、抑制血管紧张素、抗氧化等作用，其中灵芝酸C1和灵芝酸F对抗肿瘤具有较好的疗效。

中国专利CN 102532231A中，由灵芝子实体份直接采用超临界二氧化碳提取分离灵芝酸。由于超临界二氧化碳是非极性溶剂，适合提取非极性或极性低的成分，而灵芝酸这类极性比较大的成分就难以提取出来，因此采用超临界二氧化碳提取灵芝酸不仅得率低，更重要是灵芝内的非极性和极性低的成分被优先提取出来，大大降低了提取物中灵芝酸的纯度，因此该方法所得灵芝酸纯度一般低于20%，由于灵芝A只是灵芝内所包含的几十种灵芝酸中的一种，因此灵芝酸A在该提取物中低于10%。由于样品的纯度低，杂质多，又没有经过进一步纯化就直接上高速逆流分离得95%高纯度灵芝酸A，就大大增加了高速逆流分离所用甲醇、氯仿等有毒溶剂的用量，也带来环境方面问题。

中国专利CN 101671383B中，采用硅胶柱层析结合结晶的方法制备7-乙氧基灵芝酸O和灵芝酸T，虽然能得到纯度较高的灵芝酸单体，但是其分离纯化方法都存在一定的局限性。因为硅胶柱层析需要使用甲醇、氯仿等毒性较大的溶剂，且硅胶不能重复利用，用完一次就丢掉，易造成资源浪费和环境污染；而该专利中由于经硅胶初步纯化后的样品纯度不够，所以在结晶过程中需要加入高纯度灵芝酸碎晶的进行诱导结晶，这些高纯度的灵芝酸碎晶（纯度高，相当于对照品）一般都价格昂贵、不易制备，也增加了试验成本。

除上述专利外，目前暂未见采用大孔树脂层析和高速逆流色谱法联用，分离制备高纯度抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种处理量大、分离效率高、溶剂用量少的从灵芝的醇提物中分离制备高纯度抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法。

本发明的技术方案为一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法，其技术要点在于采用大孔树脂层析和高速逆流色谱的联用技术分离纯化灵芝酸的方法，它包括：

1.1大孔树脂富集纯化灵芝酸：选择大孔树脂HZ-801B、HZ-806、HZ-816、HZ-818、HZ-835或AB-8中的一种，装柱，以30%~60%乙醇溶解灵芝醇的提物并上样，按水、30%~90%乙醇，其中乙醇的浓度按10%~20%递增，依次进行梯度洗脱柱子，将灵芝酸慢慢洗脱下来，每1/15 ~1/3柱体积收集为一个馏分，每个馏分由高效液相色谱仪分析检测其成分，并合并其中主要含有灵芝酸C1和灵芝酸F的馏分，浓缩得到以灵芝酸C1和灵芝酸F为主的混合物； 

1.2高速逆流色谱法分离灵芝酸：溶剂体系由石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水组成，其体积用量比为5 : 3-7 : 1-6 : 4-9；按上述溶剂体系配制溶液，并置于分液漏斗中充分震摇后静置分层，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气15-30min，冷却至室温后备用；先将固定相以10~20mL/min流速泵入主机，待主机充满固定相后，以1.5~3mL/min泵入流动相，同时开启主机转速，主机转速600~1000转/分钟，待体系平衡后，再以流动相溶解步骤1.1制得的灵芝酸C1和灵芝酸F混合物并进样，流出液由自动部分收集器，每4~10mL收集为一个馏分，每个馏分的成分由高效液相色谱仪分析检测。