[发明专利]一种茯苓酸单体的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药活性成分的分离纯化方法，具体涉及从茯苓中提取分离茯苓酸单体的方法，属于中药分离纯化技术领域。

背景技术

茯苓酸英文名Pachymic acid，CAS：29070-92-6，分子式为C₃₃H₅₂O₅，分子量为528.76，结构式如下：

                                                 

最近有相关研究报告指出，茯苓提取物对中枢脑神经内钙离子浓度有影响作用。茯苓临床上应用在精神分裂症、抗肿瘤、水肿、婴幼儿腹泻、眩晕等，这些与传统中医理论所说的健脾补正气、增强免疫力相符合。而国外学者用茯苓的萃取物做的药理活性试验,发现茯苓具有中枢脑神经、免疫、治白斑病、抗发炎、抗氧化的作用。

茯苓酸（3-β-乙酰氧基-16-α-羟基-lanosta-8, 24(31)- 二烯-21-酸），是茯苓中所具有的一类重要活性化合物，是茯苓的特征性成分，也是一种自然存在的三萜类物质。该化合物具有抑制花生四烯酸（arachidonic acid AA）生成酶的功能。在体外研究中发现，茯苓酸以剂量依赖性和时间依赖性的模式降低细胞增生率，并且诱导细胞发生凋亡。该作用机制与茯苓酸降低Bad 磷酸化，增加Bcl-2 磷酸化，并激活半胱天冬酶(caspase)3 和9 有关，这提示着茯苓酸诱导凋亡的靶点部分或者全部与细胞线粒体上的某一位点有密切关系，茯苓酸通过调节该位点，抑制了线粒体功能，进而启动凋亡信号，最终细胞发生凋亡。因此，从原植物中分离得到茯苓酸，对药材质量控制指标、阐明其药理作用以及为新药开发寻找先导化合物具有重要的意义。

目前该化合物的制备工艺主要是以极性强的有机溶剂甲醇、乙醇长时间冷浸或回流提取，得到总的茯苓三萜成分，先将混合物上硅胶柱层析，用不同比例的甲醇/氯仿进行梯度洗脱，分段收集洗脱液浓缩至干，再利用重复硅胶柱层析或反相HPLC制备柱进行分离，得到单一成分在有机溶剂中重结晶。由于制备工艺中采用多次正相硅胶柱层析或者反相HPLC制备，且洗脱流动相为混合有机试剂，试剂难以回收重复利用，同时还用到了毒性大的氯仿试剂，因此制备工艺复杂，成本高，周期长，无法实现工业化生产。

发明内容

本发明旨在克服现有技术中工艺复杂，制备成本高，周期长，无法工业化生产的缺点，提供一种茯苓酸的分离纯化方法。该方法快速简便、成本低廉、产品纯度高（≥98%），可适用于大量制备或工业化生产茯苓酸。

为实现上述发明目的，本发明采用的具体技术方案如下：

一种茯苓酸单体的分离纯化方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

A、提取

将茯苓粉碎成粗粉，加入质量百分比浓度为95%的乙醇溶液，其加入量为药材重量：乙醇溶液体积=1Kg：8-15L，回流提取3-5次，每次1.5-3小时，提取液过滤，合并过滤液，减压浓缩回收乙醇，得50℃下相对密度为1.30-1.40的浓浸膏；

采用药材8-15倍量的95%乙醇作为提取溶剂，在保证试剂成本前提下，可以使药材得到最大利用率。

B、萃取

将步骤A所得的浓浸膏按1：10的体积比加水分散，用石油醚萃取3-5次，除去石油醚萃取液，水相用乙酸乙酯萃取4-6次，合并乙酸乙酯萃取液，回收滤液至干，得灰白色的茯苓酸粗品。提取浸膏中除了产品外，同时还含有许多油脂类的非极性成分和糖类的大极性成分；

加水分散，能够让浸膏中的糖类成分溶在水中；石油醚萃取可以预先除去油脂等非极性成分，再用乙酸乙酯萃取就能够使分散在水中的茯苓酸得到富集。

C、结晶

将步骤B得到的茯苓酸粗品溶于丙酮中，茯苓酸粗品：丙酮=1g：10-1000ml，待茯苓酸粗品完全溶解后用纳米有机膜过滤，然后按体积比于滤液中加入2-5倍的蒸馏水进行冷藏结晶，重复结晶2-3次，直至纯度≥98%，再于100℃干燥1小时即得到茯苓酸单体产品。

由于经过乙酸乙酯萃取得到的只是茯苓酸的粗品，产品纯度小于98%，因而通过丙酮完全溶解样品，用重结晶的方式即可进一步除去产品中的杂质。

步骤B中所述的石油醚可用正己烷或环己烷替代。

步骤B中所述的乙酸乙酯可用乙醚或氯仿替代。

步骤C中所述的重结晶溶剂丙酮可用甲醇或乙醇替代。

所述茯苓酸单体产品纯度的复检采用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）法，色谱条件如下：