[发明专利]一种碱性脂肪酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于功能基因改造与筛选技术领域，具体涉及一种碱性脂肪酶体变体及其应用。

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它能催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶的基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链，它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构（Schmid等,1998）。

碱性脂肪酶是在碱性条件下水解的脂肪酶，生产的主要原料为小麦、玉米等农副产物，通过生物发酵技术转化。它可以水解天然油脂，生产脂肪酸和甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。

目前碱性脂肪酶主要应用于洗涤剂行业，单独或与碱性蛋白酶一起添加在洗涤剂中，作为洗涤剂的一种添加成分，它有助于脂肪油渍和人体皮脂污垢的去除。人们通过对织物的污垢进行分析发现，由人体皮脂腺分泌的皮脂类污垢约占总污垢的四分之三以上，仅靠表面活性剂和助剂的作用是不能完全去除的，添加于洗涤剂中的脂肪酶可将这些难于除去的脂类物质降解为易于出去的物质，从而提高洗涤剂的去污效果。1988年，丹麦NoVo公司报道了碱性脂肪酶在洗涤剂中的应用，并将其投入到工业化生产中。日本狮子油脂公司同年也推出了加脂肪酶的洗衣粉。P&G公司和联合利华公司等中外合资公司也推出了含脂肪酶和蛋白酶的高档洗衣粉，但目前脂肪酶完全依赖进口。国内对碱性脂肪酶的研究起步较晚，在碱性脂肪酶发酵菌种、提取工艺、酶活性以及颗粒酶制备技术等方面与国外的先进技术有很大的差距，急需开发新的酶学性质优良、产量高的碱性脂肪酶，提高洗涤效果，并降低生产成本，从而促进碱性脂肪酶的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型碱性脂肪酶突变体及其应用，本发明通过定向进化技术对黑葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）的碱性脂肪酶进行突变，筛选到一种耐低温、耐碱的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的基因工程菌株，有利于实现该突变体的工业化生产和在洗涤领域的广泛应用。

本发明一个方面涉及一种碱性脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶的第207位氨基酸由Ala变为Gln，第252位氨基酸由Gly变为Asp，第270位氨基酸由Asn变为Gln。

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面涉及携带有编码序列为SEQ ID NO：4的脂肪酶突变体基因的重组质粒。

本发明还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。

所述工程菌株为毕赤酵母（Pichia pastoris）。

本发明还涉及上述碱性脂肪酶突变体在洗涤剂中的应用。

本发明提供了一种碱性脂肪酶突变体，并通过构建毕赤酵母工程菌高效体外表达该脂肪酶突变体，发酵酶活高达1697U/mL。本发明所述碱性脂肪酶突变体的最适作用温度为15℃，且在15-25℃的较低温条件下仍能保持95%以上的酶活力，比野生型在低温下的酶活水平更高；所述碱性脂肪酶突变体的最适作用pH值为9.5，且在pH9.0-13.0范围内能保持50%以上的酶活，比野生型在碱性条件下的酶活力更高，其作用pH范围更为宽泛。本发明所述碱性脂肪酶突变体在低温、碱性条件下酶活水平高的特性，特别适合应用于洗涤领域。通过在洗涤剂中添加本发明所述碱性脂肪酶突变体，能显著提高污布的白度，且在低温和碱性条件下效果更好，因此本发明提供的碱性脂肪酶突变体具有更广阔的市场空间。

附图说明

图1:为毕赤酵母Lip3404和毕赤酵母Lip-15发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指34kD处为重组表达的碱性脂肪酶。

图2:为本发明碱性脂肪酶突变体与野生型的最适作用pH比较图。

图3:为本发明碱性脂肪酶突变体与野生型的最适作用温度比较图。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。

实施例1碱性脂肪酶基因的合成与扩增

使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从黑葡萄穗霉过夜培养物中提取基因组DNA。

以黑葡萄穗霉基因组DNA为模板扩增黑葡萄穗霉中的碱性脂肪酶基因Lip3404，其中所用到的正向引物F序列为(下划线所示序列为EcoRI酶切位点)；