[发明专利]小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途

说明书

技术领域

本发明涉及小鼠胚胎肝基质细胞KM3的新用途，是经处理后直接可用作人胚胎干细胞稳定传代培养的饲养层细胞。

背景技术

人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）培养体系依据是否使用饲养层可分为两种，一种是饲养层培养体系，另一种是无饲养层培养体系。无饲养层培养体系中需添加各种细胞因子，试剂价格相对昂贵，稳定传代还有待观察，所以在大规模培养hESCs性价比并不高。饲养层培养体系是普遍采用的方法，小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）是最经典和最常用的饲养层细胞，但其制备过程繁琐，细胞增殖有限，5-6代后就不宜再作为饲养层。我们从小鼠胚胎肝中得到了一株永生化小鼠胚胎肝基质细胞系（命名为KM3），其可以支持hESCs的稳定生长和传代【Jiabo Hu,Sanqiang Hu,Quanhui Ma,Xiaohui Wang,Zhongwei Zhou,Wei Zhang,Xiaochun Sun,Wei Zhu,HuiQian,WenrongXu.Immortalized mousefetal liver stromal cells support growth and maintenance of human embryonic stem cells,Oncology Reports,2012,28(5):1385-1391.】，但在人胚胎干细胞培养过程中，需要不断传代维持新鲜KM3，费时，费力，影响因素多。我们的目的就是制备一种可以保存并且可以即时利用的hESCs饲养层细胞。

发明内容

为了保证人胚胎干细胞的稳定连续培养，本发明提供一种可用于人胚胎干细胞传代培养的饲养层细胞，使人胚胎干细胞的培养更高效、简便和经济。

本发明选择适合的丝裂霉素C浓度，在适合的丝裂霉素C浓度下，处理KM3细胞，将处理后的细胞在液氮中冻存60d之后对其进行复苏。复苏后的细胞形态学与新鲜处理的细胞未见明显的差别，可以支持人胚胎干细胞的稳定传代。

本发明公开了小鼠胚胎肝基质细胞KM3作为人胚胎干细胞饲养层细胞的用途。

具体地，KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞可直接作为人胚胎干细胞的饲养层使用。

本发明还提供了一种人胚胎干细胞饲养层的制备方法，是将KM3细胞经过丝裂霉素C处理，在液氮中冻存，复苏后细胞作为人胚胎干细胞的饲养层。

具体地，当KM3细胞融合度达到80%-90%时，细胞经过10μg/ml的丝裂霉素C处

理后，在液氮中冻存60d，在60d内任意时间复苏，即得到人胚胎干细胞的饲养层。

本发明有益效果是：丝裂霉素C处理的KM3细胞冻存60d后可以直接作为饲养层细胞支持人胚胎干细胞稳定传代。

附图说明

下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。

图1是KM3饲养层细胞经过10μg/ml丝裂霉素C处理。

图2是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层细胞HE染色。

图3是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层细胞培养7天之后生长状态。

图4是液氮冻存60d复苏后KM3饲养层支持人胚胎干细胞生长情况。

具体实施方式

实施例：

实验方法

1.KM3细胞冻存25cm²培养瓶内KM3细胞培养至80%-90%融合时，弃掉营养液，加入2ml浓度为10μg/ml的丝裂霉素C处理，置37℃培养箱2h。弃丝裂霉素C，用PBS洗5次,每次2min。0.25％胰酶消化1min,800rpm离心5min，弃上清，收集KM3细胞，将预先配好的冻存液（FBS：DMSO=9:1）7.5ml加入收集的KM3细胞管中，混匀，冻存管分装（分装5管,毎管1.5ml），程序降温，4℃30min,-20℃2h，-70℃过夜，然后于液氮中冻存60d。