[发明专利]一种鉴定恶性胸腔积液的方法

说明书

技术领域

本发明属于恶性胸腔积液检测方法技术领域，具体涉及一种利用CD14⁺ CD163⁺细胞鉴定恶性胸腔积液的方法。

背景技术

胸腔积液是一种常见的临床表现。胸腔积液产生的原因很多，有由肿瘤细胞直接侵犯或血性扩散引起的胸膜转移而形成的恶性胸腔积液，也有由其他良性原因出现，如：肿瘤合并心衰，结核等引起的炎性胸腔积液。恶性胸腔积液是肿瘤病人的一个常见的临床表现，因此对胸腔积液良恶性质的判断与治疗和预后密切相关。

目前临床上诊断和鉴定胸腔积液的方法包括临床表现、胸腔穿刺的化验结果、胸膜活检、气管镜、外科活检等，其中最常用的方法是采用胸腔穿刺进行细胞学检查，如果在胸腔积液中发现肿瘤细胞即可确诊为恶性，同时其它方法可作为辅助性手段帮助确诊。但是由于胸腔积液中细胞成分复杂，利用细胞学检测法来鉴定胸腔积液是良恶性存在敏感性较低、主观性较强的弊端，容易造成漏诊或误诊，因此需要寻找新的更敏感可靠的检测指标。

现有研究一般认为，恶性胸腔积液是一种特殊的肿瘤微环境，除肿瘤细胞外，还含有大量的淋巴细胞、巨噬细胞以及成纤维细胞等。浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞被称为肿瘤相关性巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)。既往研究认为TAMs具有重要的抗肿瘤免疫调节作用，可以直接杀伤肿瘤细胞，或者通过递呈肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答清除肿瘤细胞。早期研究发现肿瘤组织浸润的TAMs释放多种细胞因子、生长因子、趋化因子，参与基质重建、肿瘤微血管、微淋巴管生成，发挥免疫抑制和逃逸等多种机制促进肿瘤的发展、浸润和转移，与生存密切相关。随着研究深入，学者们认识到TAMs在不同的肿瘤微环境刺激下发生不同性质的活化，主要包括2种类型：（1）经典激活型的巨噬细胞，又称M1型巨噬细胞，具有抑制和杀伤肿瘤细胞的作用；（2）诱导型活化型的巨噬细胞，又称M2型巨噬细胞，主要分泌抑炎性细胞因子如：Arginase-I、IL-10（Interleukin10，IL-10）、TGF-β（Transforming growth factor-beta 1），具有促进血管生成、有助于肿瘤增长及免疫抑制功能。

CD163 原名血红蛋白清道夫受体，最早于1987年被Zwadlo 在体外培养的单核细胞中发现，并被认为是一种主要与炎症反应有关的急性时相反应蛋白。目前的研究认为，CD163 是一种仅在单核/巨噬细胞系统细胞膜上特异性表达的单链跨膜糖蛋白分子，为富含半胱氨酸的清道夫受体超家族(scavenger receptor cysteine-rich super family，SRCR-SF)中的一员，其分子量为130 kDa。CD163 的结构由胞外段、跨膜区和胞质内段三部分构成，其胞外段有两种变异型，其中一种含9 个SRCR 结构，另一种则仅含前3 个SRCR 结构。

CD163分子作为一种单核/巨噬细胞系表面受体，已有大量文献报道其是诱导型巨噬细胞标志，并且与多种肿瘤的不良预后相关。但尚未见到关于CD163分子与恶性胸腔积液的相关性及其在鉴定恶性胸腔积液应用的研究报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用CD14⁺ CD163⁺细胞来鉴定恶性胸腔积液的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种利用CD14⁺ CD163⁺细胞鉴定恶性胸腔积液的方法，包括以下步骤：

（1）提取单个核细胞：采集100ml胸腔积液；1500~2000 转/min，离心7~10 min，优选1500转/min，离心10 min，弃上清；PBS缓冲液冲洗一次，弃上清；将沉淀细胞用30 ml PBS缓冲液重悬细胞后置于15ml淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用PBS缓冲液冲洗三次；

所述PBS缓冲液为无钙离子、无镁离子的磷酸盐缓冲液；

所述PBS缓冲液冲洗为1500~2000 转/min条件下，离心7~10 min，优选1500转/min，离心10 min；

所述密度梯度离心为2500转/min条件下，离心20~25 min，优选离心25min；

（2）抗体标记：将步骤（1）获得的胸腔积液单个核细胞，取1×10⁵~1×10⁶ 个细胞，加入细胞表面荧光抗体进行染色，室温避光孵育15min；