[发明专利]基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法

权利要求书

1.一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于包括以下具体步骤：

（1）三联吡啶钌的合成：

①称取：二氯双(2,2'-联吡啶)钌0.05g，NaHCO₃0.05g，4-羧酸-2,2'-联吡啶0.0375g；

②加入10mL体积分数80%甲醇水溶液，混合液在硅油浴下回流；

③所得溶液在冰浴中冷却2h；

④用1mol/L的H₂SO₄将pH值调到4.4，形成沉淀；

⑤形成的沉淀进行过滤，收集滤液；

⑥向⑤中所得滤液中加入3.125mL NaPF₆溶液，搅拌后置于4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生；收集所得结晶即为二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐）；

（2）三联吡啶钌的活化：

①称取：二环己基碳二亚胺1.1635g，N-羟基琥珀酰亚胺0.5947g；

②搅拌条件下溶解于7.7568mL二甲基甲酰胺中，然后冰浴冷却1h；

③加入0.1616g步骤（1）合成的二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐），混合物冰浴搅拌混匀；

④室温下密封振荡；

⑤通过吸滤装置除去所得沉淀，滤液中含有活性的钌配合物，即活化三联吡啶钌；

（3）聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：

①取一管聚赖氨酸固体粉末离心；

②打开管盖，并加入75μL0.1M硼酸钠，调整pH值至8.5，盖上管盖；

③充分上下振荡5min，离心收集；

④加入30μL的步骤（2）⑤中所得到的活化三联吡啶钌；

⑤室温避光孵育12h；

⑥用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；

⑦离心，倒去滤液，加入0.5mL预冷无水乙醇，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；

⑧离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；

⑨离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；

⑩离心，将所得沉淀，加100μL水稀释，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，放入-20℃保存；

（4）DNA探针标记聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物：

该反应体系中，将聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物、DNA探针及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺混匀，调整pH值至6；避光孵育；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；得到DNA探针标记的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，并用纯水保存在-20℃；

（5）磁捕捉检测目标DNA序列：

以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法；

（Ⅰ）取生物素探针、靶序列溶解于水中，终浓度为10μM；

（Ⅱ）构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100μL，生物素探针及聚赖氨酸的终浓度为100nM，PBS缓冲液的终浓度为1×，加水补充至100μL；

（Ⅲ）信号检测：将步骤（Ⅱ）的产物，放入分析仪中检测电化学发光信号。

2.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（4）所述的将聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物、DNA探针、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺混匀按照聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物：DNA探针：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为体积比1：10：2000的比例混匀。

3.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的活化三联吡啶钌用于标记DNA、蛋白或抗体。

4.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（5）中所述的生物素探针为DNA探针。

5.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（3）和步骤（4）中所述的超滤管的截留分子量为100KDa。