[发明专利]一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法

权利要求书

1.一种利用O-甲基转移酶合成紫檀芹的基因工程菌，是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶的同时表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述芹合酶是由源自葡萄（Vitis vinife）的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将上述两个基因融合获得了编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白4CL::STS的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述O-甲基转移酶是由源自葡萄（Vitis vinife）的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是表达了SEQ ID NO.3所示融合基因以及SEQ ID NO.4所示ROMT基因的E.coli BL21（DE3）。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，是以E.coli BL21（DE3）为宿主，携带重组质粒pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT；所述pETDuet-4CLSTS是携带SEQ ID NO.3所示融合基因的pETDuet-1重组载体；所述Sumo-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体。

5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是表达了SEQ ID NO.3所示融合基因以及SEQ ID NO.4所示基因的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，是以S.cerevisiae WAT11为宿主，携带重组质粒pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT；所述pAG304GPD-4CLSTS是携带SEQ ID NO.3所示融合基因的pAG304GPD-ccdB重组载体；所述pAG305GPD-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pAG305GPD-ccdB重组载体。

7.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了SEQ ID NO.4所示基因的E.coli BL21（DE3）。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，是以E.coli BL21（DE3）为宿主，携带重组质粒Sumo-ROMT；所述Sumo-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体。

9.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达了SEQ ID NO.4所示基因的S.cerevisiae WAT11。

10.根据权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，是以S.cerevisiae WAT11为宿主，携带重组质粒pAG305GPD-ROMT；所述pAG305GPD-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pAG305GPD-ccdB重组载体。

11.一种利用权利要求3-6任一所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，是以p-香豆酸为底物生物合成紫檀芹。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，是以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养携带重组质粒pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT的E.coliBL21（DE3）至OD₆₀₀=0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养以合成紫檀芹。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，以SD drop-out培养基在30℃条件下培养携带pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞至OD₆₀₀=0.2，然后添加0.5g/L p-香豆酸，继续振荡培养4天以合成紫檀芹。