[发明专利]一株高产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株高产雷帕霉素的游动放线菌诱变菌株BCStr-096。 

背景技术

雷帕霉素(rapamycin,RPM)又名西罗莫司，是具独特作用机制的含氮三烯大环内酯类抗生素，具有抗真菌、抗增殖的作用，据报道，Luan FL等人的动物实验发现雷帕霉素还具有抗肿瘤的作用。雷帕霉素是目前世界上最有前途的新型强效免疫抑制剂，其分子结构类似于FK506，是又一种亲免疫蛋白结合剂，可用于器官移植抗排斥作用，它的免疫抑制作用比环孢菌素强数十倍，是肾毒性最低的免疫抑制剂，还可用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病，目前发展为基因治疗和抗肿瘤药物，具有广阔的应用前景。 

最初，RPM作为低毒性抗真菌抗生素，1978年发现它对自身免疫性疾病有免疫抑制作用。受此启发，1989年Mortis正式开始把RPM作为器官移植抗排斥的新型免疫抑制剂进行试用。1999年9月美国FDA正式批准雷帕霉素作为肾移植的抗排斥药物投放市场，同时由Cordis公司研发的以雷帕霉素作为涂层药物的血管支架Cypher已于2002年相继在欧洲、美国和日本上市。2005年6月我国福建省微生物研究所研发的国产雷帕霉素经SFDA批准投放市场，而由美国Wyeth公司开发的雷帕霉素作为抗癌药现已进入临床试验阶段。2006年前，雷帕霉素在美国市场的价格为6千美金1克，目前，雷帕霉素的销量正在迅速增长，其市场售价也略有降低，估计它将和环孢菌素有效地竞争，逐渐地平分抗移植器官排异药的市场，Pharmaprojects（在研新药动态）预测其销售额达5-20亿美元。雷帕霉素在国内属于六类新药，2009年雷帕霉素在国内市场的销售额已超过5亿元人民币，具有广阔的市场前景。 

目前，雷帕霉素的工业化生产主要是通过微生物发酵方法生产，但目前该抗生素的发酵水平还相当低，有文献报道的最高发酵水平也仅达到400mg/L左右。因此，雷帕霉素生物发酵生产存在的不足主要在于雷帕霉素的生物发酵单位不高，不利于提取纯化，不能充分满足工业化生产的要求。 

本发明利用常压室温等离子体诱变技术，筛选出一株雷帕霉素高产菌株，提高了雷帕霉素的产量，有效降低了生产成本。 

发明内容

本发明所要解决的问题是利用常压室温等离子体诱变技术，筛选出一株新型雷帕霉素高产菌株。 

本发明所提供的菌株为游动放线菌（Actinoplanes sp.）诱变菌株BCStr-096，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.8430，分类命名：游动放线菌Actinoplanes sp.；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期2013年11月05日。该菌株是以从海南岛的土壤样品中筛选出的产雷帕霉素的游动放线菌hn-016（Actinoplanes sp.）为出发菌株，经多组复合诱变筛选得到的。 

本发明游动放线菌，具体采用以下技术方案进行选育： 

1.采用常压室温等离子体诱变技术选育雷帕霉素高产菌株 

（1）选择生长良好的产雷帕霉素的游动放线菌hn-016斜面菌株，用生理盐水洗下孢子，经纱布过滤，制成10⁶个/mL的孢子悬浮液； 

（2）将（1）中的孢子悬浮液，用移液枪吸取10μL于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气为工作气体，功率110W，工作气流量10L/min的常压室温等离子体诱变系统中，处理距离为2mm，分别处理0s、20s、40s、60s、80s、100s、120s、140s、160s、180s，将处理的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线； 

（3）根据（2）的致死率曲线，选择高、中、低三个不同致死剂量的照射时间，对菌株hn-016的孢子悬液进行等离子体诱变； 

（4）将（3）中三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀； 

（5）将（4）中的诱变孢子悬液，进行梯度稀释后，分别涂布于含有2mg/L氯霉素，0.8mg/L链霉素，4mg/L红霉素，1mg/L庆大霉素的抗性平板上； 

（6）将（5）中各个抗性平板上长出的单菌落转接斜面后，以1%的接种量，接种于种子培养基中，28℃，220r/min，培养45-50h后，以10%的接种量将种子液接种于发酵培养基，28℃，220r/min培养7-8d；