[发明专利]一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体及其构建方法。

背景技术

猪肉是我国人民主要的动物蛋白来源，对于人民的生活水平提高起到关键性作用。随着我国经济的发展，人民生活水平的提高，中国人猪肉需求量也越来越大，据统计中国每年消费的猪肉量占全世界总量的一半以上。市场的需求扩大，促进了我国现代化规模化养殖业的快速发展。但是同时也提出严峻挑战。在我国，主要畜牧类品种严重依赖于进口，猪品种依赖程度接近90%。这意味着生猪养殖的产业的源头——种畜完全被欧美市场控制，严重的威胁到我国的食品安全。培育自主知识产权的猪新品种是现阶段我国迫切需要解决的农业问题。传统的遗传选育方法周期长见效慢，难以在短期内培育出具有高生产性能猪新品种。自从1997年哺乳动物体细胞克隆技术出现以后，家畜的基因工程育种得到迅速发展，它可以针对单一性状在短期内迅速的提高家畜的生产性能。

卵泡抑素（follistatin，FST）一条多肽链组成的糖蛋白。FST具有多种生物学功能，能与转化生长因子β超家族的多个成员结合。在哺乳动物中FST转录后有两种不同的剪接形式，一种剪接mRNA编码344个氨基酸残基的蛋白（FST-344），另一种剪接体编码317个氨基酸残基的蛋白（FST-317）。FST-344和FST317翻译后修饰分别形成两种成熟蛋白——315个氨基酸残基FST315和288个氨基酸残基的FST288。FST288的C末端少了17个氨基酸残基，其与细胞表面的肝素有很强的结合能力，FST288很难从表达部位扩散到血液中；FST315的C端17个氨基酸残基减弱了其与肝素的结合能力，FST315容易表达组织扩散到血液中。FST288被认为是组织特异性的卵泡抑素蛋白，而FST315被认为是分泌型的卵泡抑素蛋白。虽然是肌肉特性的表达FST315，过量FST315能够从肌肉中扩散到血液，随着血液循环影响其他的组织和器官。血液中高浓度的FST315蛋白可能会导致生殖障碍，对转基因猪产生安全隐患。实际上肌肉特异性表达FST288的才能真正做到肌肉特异性。构建一种猪肌肉特异性表达FST288表达载体，用它制备转基因猪既能提高猪瘦肉率又能保证猪的安全。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种表达载体，增加了转基因猪的安全性。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体，所述表达载体的表达盒是猪内源性的skeletal-α-actin基因座与FST317编码cDNA融合而成，所述猪内源性的skeletal-α-actin基因调控区驱动FST317的表达。

进一步的，所述表达载体包括，

skeletal-α-actin基因5’侧翼序列，优选为skeletal-α-actin基因5’侧翼12kb的序列；

FST288编码DNA，优选的FST288是以人FST344cDNA载体为模板通过PCR扩增得到的；

skeletal-α-actin基因3’侧翼的序列，优选为skeletal-α-actin基因3’侧翼7.8kb的序列；

新霉素抗性基因（neo），在新霉素抗性基因上下游插入同向loxp可用于新霉素抗性基因的删除。

进一步的，所述的表达载体序列如序列表SEQ：ID NO：1所示。

本发明的另一目的为提供一种上述表达载体的构建方法，其技术方案如下：

一种表达载体的构建方法，利用Red/ET介导的同源重组技术，包括如下步骤：

1）将含有猪骨骼肌肌动蛋白的21kb基因座抓捕到抓捕载体上，优选的抓捕载体是通过PCR分别扩增左右同源臂后插入到pBR322-loxp-neo-loxp骨架载体构建而成；

2）将FST317基因加上抗性基因定点敲入到骨骼肌肌动蛋白的编码区，优选的抗性基因为zeocin抗性基因；

3）通过Flpase介导的位点专一性重组将抗性基因删除，表达载体构建完成。

本发明还提供了含有上述表达载体的转基因细胞系。

本发明还提供了一种上述表达载体制备转基因猪中的应用。