[发明专利]一种检测犬恶丝虫的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测犬恶丝虫的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。

背景技术

犬恶丝虫（Dirofilaria immitis）会引起血液寄生线虫病（Heartworm disease）,不仅严重影响养犬业的发展，同时也给人类健康带来严重威胁。犬恶丝虫的检测方法主要有:1）微丝蚴检查。主要通过血检微丝蚴，即可确认犬体有成虫寄生。但是，由于在犬恶丝虫感染的早期，血液中不能检测到微丝蚴，且在自然感染犬恶丝虫的犬中有10%-67%为单性感染，不能产生微丝蚴，导致该法容易出现假阴性。同时，成虫寄生数量较少或采血时间、采血位置不当等也会影响微丝蚴的检出率。并且在实际检测中约有20%以上感染犬用此法检测会出现假阴性；2）可以采用血液学检查、心血管检查和X线检查进行辅助检测。此方法对设备仪器有较高的要求，对于广泛使用有一定的困难；3）免疫学方法。通过检测犬恶丝虫抗原或抗犬恶丝虫抗体，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）和商品化诊断试剂盒等在内的免疫学技术已经被逐渐应用于检测犬恶丝虫;4）分子生物学诊断。主要通过PCR方法检测，该方法具有较高的灵敏性和特异性。然而现有的PCR方法的灵敏度不够,不能对犬恶丝虫进行快速、有效和准确的分子检测。尤其重要的是，犬恶丝虫病的感染潜伏期较长且多为隐性感染，而现有的市场监测方法因灵敏度不够,而出现较高的假阴性率。

发明内容

鉴于犬恶丝虫引起的感染潜伏期较长且多为隐性感染，而现有检测犬恶丝虫的方法的假阴性率较高，急建立一种能够敏感、特异、快速、准确地检测犬恶丝虫（Dirofilaria immitis）核酸的分子诊断方法。为解决此技术问题，本发明提供了一种检测犬恶丝虫的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。

本发明通过在病原5.8S rRNA上选择了一个相对保守的区域作为目的片段设计相关引物和探针，发明一种高度灵敏可特异性扩增犬恶丝虫核酸的PCR系统，且该系统不扩增恶丝虫属的其他种属的核酸，如D.repens,D.tenuis,D.ursi等。优化试验保证此发明技术的特异性和敏感性。

从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下相关的rRNA基因的序列后（AF217800，EU087700），用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对，设计了一对引物和一对探针。

本发明所述一种检测犬恶丝虫的荧光定量PCR引物和探针，其序列如下：

上游引物：5’-TTCAATAACTCTAAGCGGGGGATCACCT-3’（SEQ ID NO.1）

下游引物：5’-TCTGATCGATATTGACCCTCAACCAGA C-3’（SEQ ID NO.2）

6-FAM探针：5’-TGCAGACGCATTGAGCACAAAGATTTC-(6-FAM)-3’（SEQ ID NO.3）

LCRed640探针：5’-LCRED640-AATGCACATTGCACCATCGGGTTG A-磷酸-3‘（SEQ ID NO.4）

本发明还提供了检测犬恶丝虫的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括5x FRET-qPCR Stock22微升,22微升的5x的寡核苷酸混合物（含浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物、1μM的6-FAM探针、1μM的LCRed640探针，以及5个单位的高保真DNA聚合酶）。

采用上述引物和探针可通过FRET-PCR技术对犬恶丝虫进行检测可特异扩增引起犬恶丝虫病的唯一病原体-犬恶丝虫的核酸，而不扩增其它类似但不引起犬恶丝虫病的丝虫的核酸（如D.repens,D.tebuis等）。

FRET-PCR特异性的确定。设计的引物和探针经过GenBank的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增犬恶丝虫5.8s rRNA基因片段，而不扩增其它类似而不导致犬恶丝虫病的种属的基因片段。此外，观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度（640nm）的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中条带的大小。荧光在640nm波长出现或增强，显示阳性；PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示预期的172bp的条带；对扩增的PCR产物进行测序，测序的结果和GenBank的犬恶丝虫标准序列进行比对。