[发明专利]一种重组蛋白的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是指一种基因工程菌表达的重组蛋白提取纯化方法。

背景技术

通常外源基因的表达，特别是来自真核生物的基因在原核生物（如大肠杆菌）中的表达，由于宿主菌缺乏此种基因相应的表达调控机制，以及细胞内的化学环境与其天然环境差异（如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度等），这些使得宿主的细胞在非正常状态下生长，导致所表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。

包涵体是微生物细胞中密度最大的结构，密度在1.1-1.3之间，对机械搅拌和超声破碎作用不敏感。以包涵体形式表达的蛋白质在下游生产过程中具有一些优越性。表现在：

（1）异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，而以包涵体形式表达重组蛋白质，由于包埋了蛋白酶水解的作用位点，可以最大限度地降低细胞内降解；

（2）包涵体蛋白没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质高级结构变化引起的失活问题；

（3）与可溶性形式表达的重组蛋白相比，包涵体形式表达的蛋白与宿主细胞其他蛋白的分离更加简便和低成本，使用简单的离心或者过滤方法就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白成分进行有效的分离；

（4）有些表达的外源蛋白对细胞有毒性或致死效应，大量表达时会导致细胞的生长缓慢或死亡，最终的细胞数量和产物相当低，而以包涵体形式表达的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达和积累。

以包涵体表达的重组蛋白提取纯化方法通常为：工程发酵和诱导表达，离心收集细胞，细胞破碎，离心收集沉淀，包涵体洗涤，离心收集沉淀（重复洗涤离心若干次），包涵体变性溶解，离心收集上清，纯化（亲和纯化和稀释沉淀法等）。此类方法有如下缺点：

（1）操作繁琐，需要多次离心操作，成本高，不适合放大连续操作。

（2）所用溶剂种类多，细胞破碎，包涵体清洗，包涵体溶解纯化都需要多种特定的缓冲液，成本高，不利于大规模生产。

发明内容

为克服已有技术存在的问题，本发明的目的提供一种工艺简单，所需要的溶剂少，成本低，产品的纯度和回收均高，适合大批量生产重组蛋白的纯化方法。

本发明提供的重组蛋白的提取纯化方法，按照下述步骤进行：

（1）安装逆流超声设备，超声波控制器控制聚能式超声波探头发出超声作用于杯型超声腔缓冲液A中，超声腔进出口带有阀门A和阀门B，蠕动泵通过两条管道与烧杯中缓冲液B连接，烧杯中缓冲液B在搅拌器的搅拌已保证充分反应，烧杯置于装有冰水混合物的容器中，液体的定向循环流动由安装在进口管道上的蠕动泵完成。

（2）取重组大肠杆菌单克隆接种至含卡那霉素（50 μg/ml）LB液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0）恒温摇床培养过夜，将过夜菌接种于同样培养基中，其中接种量为1%，恒温摇床培养至OD₆₀₀为0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度 1 mM，28℃-37℃诱导培养6 h-12h，离心收集湿菌体，进行反复冻融法处理（-20°C/37°C）5次。

（3）关上逆流超声设备的阀门，超声腔中加入工程菌湿菌体和缓冲溶液A（50 mM Tris，10 mM EDTA，100 mM NaCl，pH 7.5），其中工程菌和缓冲溶液A的质量与体积比为1：30（g/ml）。利用超声（400-600W）进行细胞破碎处理，至液体变稀，镜检细菌破碎率为98%。

（4）在冰浴的烧杯中加入缓冲溶液B（50 mM Tris，10 mM EDTA，100 mM NaCl，1.5-2 M urea，pH 7.5），打开逆流超声设备的阀门，打开蠕动泵，打开搅拌器，使液体在超声腔和烧杯内循环，超声工作15 min-20 min（400-600 W）；其中缓冲溶液A和缓冲溶液B的体积比为1：3。

（5）将混合液于4℃下8000 rpm离心20 min，收集沉淀，溶于6-8 M尿素，4℃下10000 rpm离心20 min取上清，上清液经脱盐柱脱盐得纯化重组蛋白。

本发明的优点：