[发明专利]水稻转基因遗传转化方法

权利要求书

1.一种水稻转基因遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1.0）愈伤组织诱导

即选取饱满的水稻种子剥去颖壳，用乙醇浸泡，随后用升汞溶液浸泡，再用无菌水漂洗，之后接种于诱导培养基上培养；愈伤组织经过2～3次继代后，挑选生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织继代备用；

（2.0）饥饿处理

即挑选上述步骤（1.0）继代后生长状况较好、组织松散、淡黄色颗粒状的愈伤组织置于瓶中，在合适温度下饥饿处理，备用；

（3.0）侵染

（3.1）在无菌条件下，从固体细菌培养基上挑取一株农杆菌单菌落接于含有抗生素的液体细菌培养基中，在恒温摇床上振荡过夜培养；

（3.2）将上述步骤（3.1）中过夜培养的菌液转至离心管中离心，收集菌体；

（3.3）将上述步骤（3.2）离心后的菌液弃去离心管中的上清液，再向收集的菌体中加入适量新鲜的液体细菌培养基，接着从离心管中取出适量的菌液加入到液体细菌培养基中，直至农杆菌的浓度适当即可，再加入乙酞丁香酮，用于侵染农杆菌；

（3.4）将上述步骤（2.0）中饥饿处理后的胚性愈伤组织置于一定浓度的钙离子侵染液中侵染一定时间后，再置于滤纸上吸干备用；

（4.0）培养

（4.1）共培养，即将上述步骤（3.4）获得的愈伤组织转置共培养培养基中，在合适温度条件暗培养；

（4.2）恢复培养，即将上述步骤（4.1）中获得的愈伤组织用无菌水清洗，然后用无菌滤纸吸干，转置恢复培养基中，在合适温度条件下光照培养；

（4.3）筛选培养，即将上述步骤（4.2）获得的愈伤组织转置筛选培养基中，在合适温度条件光照培养，并根据情况适时更换培养基；

（4.4）分化培养，即将上述步骤（4.3）获得新鲜、疏散且呈淡黄色的愈伤组织放置于分化培养基中培养，在合适温度条件光照培养，并根据情况适时更换培养基；待分化出的不定芽长到一定长度时，将其小心移入生根培养基中诱导生根。

2.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（1.0）中将剥去颖壳的种子用70%～75%乙醇浸泡4～5min，随后用0.1%～0.2%的升汞溶液浸泡10～20min，再用无菌水漂洗3～5次，之后接种于诱导培养基上培养；

所述诱导培养基由N6培养基、2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、2.0mg/L的脱落酸、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的琼脂粉组成。

3.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（2.0）中是将挑选好的愈伤组织置于100～200mL三角瓶中，在20～25℃的温度条件下饥饿处理2～5天，备用。

4.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（3.1）中是将挑取的农杆菌单菌落接于50～100mL含有40～60mg/L抗生素的液体细菌培养基中，在25～28℃，150～200r/min的恒温摇床上振荡过夜培养；

所述步骤（3.2）是将所述步骤（3.1）中过夜培养的菌液转至离心管中，在4～6℃下，4000～6000rpm/min，离心8～15min，收集菌体；

所述步骤（3.3）中是将从离心管中取出适量的菌液加入到含有20～50mM CaCl₂的液体细菌培养基中，直至农杆菌的浓度适当即可，再加入80～100μL10～20mg/mL的乙酞丁香酮，用于侵染农杆菌；

所述步骤（3.4）中是将所述步骤（1.0）中继代好的胚性愈伤组织置于一定浓度的钙离子侵染液中侵染30～60min。

5.如权利要求1所述的水稻转基因遗传转化方法，其特征在于：所述步骤（4.1）中是将第三步获得的愈伤组织转置于共培养培养基中，在22～28℃的温度条件暗培养2～4天；

所述共培养培养基由N6培养基、2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、20mg/L的乙酰丁香酮、0.5g/L的L-脯氨酸、0.5g/L的水解酪蛋白、30g/L的蔗糖及7g/L的琼脂粉组成。